分离实验报告.docx
《分离实验报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分离实验报告.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
分离实验报告
溶菌酶的别离纯化
姓名：
杨兴旭学号：
060516211
、实验目的
（1）利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶
（2）进行溶菌酶活力和比活力的测定（比浊法）
（3）进行溶菌酶纯度检测（SDS-PAG）E
、实验原理
溶菌酶（lysozyme,简称LZM）是由英国弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-B-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG与N-乙酰胞壁酸（NAM间的B-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da,由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度
A1%
为50C,其最适PH在6〜7左右。
在280nm的消光系数［A1cm］为13.0。
该酶活性可被一些金属离子CiTFe2+、Zn2+（10-5〜10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg+、Cf（10-5〜10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋（含量约为2%〜4%）和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并别离纯化。
大多数从蛋清中提取别离得到的溶菌酶，是一种碱性球蛋白有4对二硫键维持酶构型，其分子由18种共129个氨基酸残基组成，分子量为14000Da左右。
其纯品为白色、微黄色或黄色的晶体或无定型粉末，无嗅，易溶解于水，不溶于丙酮、乙醚等。
等电点PI为10.7~11.0。
溶菌酶非常稳定，在pH值为1.2~11.3内剧烈变化时，其结构几乎不变。
在酸性条件下，热稳定性很好。
pH值在4~7时，100C处理1min，仍保存较好的活力。
但在碱性条件下，尤其当pH升至9时，溶菌酶耐热性较差，易变性。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在别离制备时，先采用等电点法粗别离，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶，分光光度法测定酶活性及比活力，最后用SDS-PAG鉴定。
三、实验材料、试剂及仪器
鸡蛋假设干、D152大孔弱酸性阳离子交换树脂色谱柱、烧杯（100mL,250mL，
1000mL）、锥形瓶（100mL）、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒（100mL,250mL，1000mL）、10mL离心管、1.5mLEp管、高速离心机、冰箱、SDS-PAG电泳设备、电炉、紫外分光光度计
固体氯化钠（NaCI）;固体硫酸铵（NH4）2SQ;固体磷酸氢二钠（NaHPG12HC）;固体磷酸二氢钠（NaHPO・2H2O）;固体磷酸钠（NaPQ）;乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮；溶菌酶标准品；N-乙酰葡萄糖胺；
硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸SDS聚丙烯
酰胺凝胶电泳试剂；聚乙二醇-20000、两性电解质
试剂配制：
30%丙烯酰胺贮存液：
准确称取29.2g丙稀酰胺、0.8gN,N'-甲叉双丙稀酰胺，加少量蒸馏水溶解后定再容至100mL过滤，放纵于4C冰箱保存。
别离胶缓冲液（1.5moI/LpH=8.8Tris-HCI缓冲液）：
取18.2gTris，加少量蒸馏水溶解，用1moI/L盐酸调节pH至8.8（约48ml）后，定容至100mL。
浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl缓冲液）：
取6.0gTris，加
少量蒸馏水溶解。
用1moI/L盐酸调节pH至6.8（约48mL）后，定容至100mL
4%&缩胶（10mL）:
0.5moI/LpH=6.8Tris-HCI2.5mL,胶贮液1.3mL，10%SDS100uI，TEMED10uI，10%AP100uI，双蒸水6.1mL。
12%别离胶（20mL）：
1.5moI/LpH=8.8Tris-HCI5mL,胶贮液8mL，10%
SDS200uI，TEMED8uI，10%AP200uI，双蒸水6.6mL。
pH=8.3Tris-GIy电泳缓冲液：
Tris6g、glycine28.8g、SDS1g，力卩
少量蒸馏水溶解，pH调至8.3，定容至1L0
考马斯亮蓝染色液：
1.25g考马斯亮蓝R250450mL甲醇：
水〔1:
1〕50mL冰醋酸。
脱色液：
450mL甲醇：
水〔1：
1〕、50mL冰醋酸。
0.02mol/LPBS〔pH=8.0〕:
取5.3mL0.2MNaHPQ溶液，94.7mL0.2MNaHPQ溶液，加蒸馏水稀释至1000mL，混匀
四、实验方法
溶菌酶提取纯化：
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化
离子交换法是根据溶液中被别离物质的带电差异，而与离子交换剂之间结合力的大小差异，到达别离纯化目的的操作技术。
由于该方法具有良好的生物相容性、简便、高效、且可自动化连续操作等优点，是溶菌酶生产的常用方法。
溶菌酶为碱性蛋白质，等电点为10.7〜11.0，蛋清中其他主要蛋白质等电点均低于6.0，因此根据与其他蛋白质等电点的差异，选用离子交换法进行溶菌酶的提取。
溶菌酶等电点为较高，在蛋清中带正电荷，因此应选用阳离子交换树脂进行吸附。
强酸性阳离子交换树脂的主要交换基团为-SQH,由于强阳离子交换剂与酶作用较强，在洗脱过程中，溶菌酶难以洗脱，且易导致蛋白质的变性。
溶菌酶活力比活力测定：
溶菌酶活力和比活力的测定〔比浊法〕
比活力测定：
采用分光光度法。
溶菌酶在281nm波长处有最大吸收峰，制备不同浓度的溶菌酶溶液，在281nm波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，可求出标准曲线回归方程。
溶菌酶酶活力测定方法采用比浊法。
溶菌酶能水解溶壁微球菌，使菌悬液在450nm波长处的吸光度下降。
以此测定溶菌酶酶活力。
酶活力定义：
在25C下，pH值6.2时，每分钟溶壁微球菌菌悬液0阪值下降0.001为一个活力单位〔U〕。
溶菌酶纯度检测：
溶菌酶纯度检测〔SDS-PAG〕E
五、实验步骤
1、溶菌酶的粗提取
取实验用鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，然后用两层纱布过滤，去除脐带和蛋壳。
记录其体积Vi
J
参加1.5倍体积的pH=8.0PBS缓冲液，搅拌均匀
用冰醋酸调pH=4.7左右，充分搅拌
J
3500rpm，离心20min
弃沉淀，转移上清至烧杯中
参加1倍体积的pH=8.0PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/LNaOH调pH=8.0
滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2
j
取0.5mL清液并参加等量甘油于1.5mLEp管中，制备2管，-20C备
用
余下的清液分装在10mL离心管中-20C冻存备用。
〔样品S〕
蛋清的制备操作：
将4〜5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出〔鸡蛋清pH值不得小于8〕，轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.
鸡蛋清粗别离
按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边参加等体积的去离子水，均匀后在不断
搅拌下用1mol/LHCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
2、溶菌酶的别离纯化
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析
〔1〕D152树脂处理：
将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/LNaOH搅拌浸泡并搅拌4〜8小时，抽滤去除杂质NaOH,用蒸馏水洗至近pH=7.5,进行抽滤，再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤除去
HCI,用蒸馏水清洗致近pH=5.5，保持过夜，如果pH值不低于5.0，抽滤除去HCI,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。
吸干溶液，加pH=6.50.02moI/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
〔2〕装柱：
取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，然后关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再参加一些树脂，至树脂沉积至15〜20cm高度即可。
于柱子顶部继续参加pH=6.5,0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂外表1cm左右。
〔3〕上柱吸附：
将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，翻开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。
〔4〕洗脱：
用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/LNaCl的pH值6.5，浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。
〔5〕聚乙二醇浓缩：
将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就被透析膜外的聚乙二醇所吸收，当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。
〔6〕透析除盐：
蒸馏水透析除盐24小时。
3、溶菌酶活力测定
〔1〕酶液配制：
准确称取溶菌酶样品5mg,用0.1mol/L,pH=6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将配制酶液稀释成50用/ml.
〔2〕底物配制：
取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在研钵中〔或匀浆器中〕研磨2分钟，倾出，稀释到15〜25ml，此时在比色上的吸光度最好在0.5〜0.7范围内。
〔3〕活力测定：
先将酶和底物分别放入25OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。
然后吸取样品液0.2mL〔相当于10⑥酶〕，每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。
〔5〕活力单位的定义是：
在25C,pH=6.2,波长为450nm时，每分引起吸光
度下降0.001为1个活力单位
酶的活力单位数=AA45°nm/tX0.001
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
【实验结果】
体积总蛋白总活力比活力
步骤工程
制备蛋清
溶菌酶别离
D152树脂柱层析
SephadexG50层析
4、溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
〔1〕蛋白样品的处理
取200Z上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，参加200卩L的2X上样
缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100C沸
水浴中加热3〜5min，取出后10000r/min离心10min，取上清待用。
1电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。
〔试样格〔梳子〕临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。
〕
2按比例配好别离胶，用移液管快速参加，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。
〔凝胶配制过程要迅速,催化剂TEME要在注胶前再参加,否那么凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成，防止产生气泡。
水封的目的是为了使别离胶上延平直，并排除气泡。
凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
〕
3倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳参加浓缩胶直至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置。
〔样梳需要一次平稳插入，梳口处不得有气泡,梳底需水平。
〕
4拔出样梳后，在上槽内参加缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。
〔要使锯齿孔内的气泡全部排出，否那么会影响加样的效果.〕
5加样，从第一个开始按已编排好的顺序依次参加蛋白Marker和相应体积的样品。
其中Marker和样品加样量均为20卩L。
〔微量移液器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高，在样下沉时会发生扩散。
为防止边缘效应，最好选用中部的孔注样。
〕
6电泳槽中参加缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20mA,当进
入别离胶后改为30mA溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
7凝胶板剥离与染色：
电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切
下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，参加染色液，42C染色40min
左右。
〔剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
〕
8脱色：
染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
9将凝胶扫描分析，求出溶菌酶的相对分子质量。
试剂
15%分离胶〔10mL〕
5%浓缩胶（4mL）
H2O
2.3
2.7
30灿烯酰胺溶液
5.0
0.67
1.5MTris-HCI
（pH=8.8）
2.5
—
1.5MTris-HCl
（pH=6.8）
—
0.5
10%SDS
0.1
0.04
10%AP
0.1
0.04
TEMED
0.004
0.004
六、考前须知
1.等电点沉淀后利用离心的方法，要尽量除去沉淀;
2.调节pH时要防止局部过酸；
3.提取过程中尽量防止泡沫的产生
4.加样蛋白浓度低于20mg/mL,上样的体积小于柱体积的1/3。
5.在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。
过大，会使填料压缩紧密,导致流速过低,层析柱有可能堵塞而实验失败,流速过小,实验时间过长，引起酶的活性变化。
对于CM-SepharoseFF填料，在最适宜流速在100cm/h以下。
因此,在我们的实验中,控制流速为2mL/min。
6.冲平过程一定不能省。
因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。
7.N,N'-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应防止其直接接触皮肤，必要时应戴手套。
但其凝固后就变成无毒物质。
8.安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防止缓冲液渗漏。
9.用琼脂〔糖〕封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。
10.加样时样品不能超出凹形样品槽。
加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
11.实验试剂使用应当注意平安操作；做好防护及应急处理工作。
溶菌酶酶活力的测定方法二溶菌酶标准曲线的绘制
采用分光光度法：
溶菌酶在281nm波长处有最大吸收峰，制备不同浓度的溶菌酶溶液，在281nm波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，可求出标准曲线回归方程。
试剂配制
0.9%氯化钠溶液：
称取氯化钠9.0g，溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
溶菌酶标准工作液：
准确称取溶菌酶标准品50mg,以浓度为0.9%的NaCl
溶液溶解并定容至100mL,得到浓度为500卩g/mL的溶菌酶标准工作液。
标准曲线的绘制
分别吸取溶菌酶标准工作液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL于25mL容量瓶中,以0.9%氯化钠溶液稀释并定容,混匀。
用10mm石英比色皿比色,以0.9%氯化钠溶液为参比溶液,在波长281nm处依次测定个标准工作液的吸光度,以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,并求出标准曲线方程。
溶菌酶酶活力的测定
溶菌酶酶活力测定方法采用比浊法。
溶菌酶能水解溶壁微球菌,使菌悬液在450nm波长处的吸光度下降。
以此测定溶菌酶酶活力。
酶活力定义：
在25r下，pH值6.2时，每分钟溶壁微球菌菌悬液OD
450值下降0.001为一个活力单位〔U〕。
试剂配制与菌液制备
0.2mol/LpH=6.2磷酸盐缓冲液：
准确称取NaHPQ•2HO31.20g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL;准确称取NaHPO・12HO71.63g，以蒸馏水溶解并定容至1000mL取NaHPO溶液815mL与NazHPO溶液185mL混合，混匀即可。
0.067mol/LpH=6.2磷酸盐缓冲液：
准确称取N@HPO・2HO10.40g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL;准确称取NstHPO・12HO23.88g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
取NqHPO溶液800mL与NaHPO溶液
200mL混合，混匀即可。
溶壁微球菌菌液制备：
将溶壁微球菌接种于灭菌的固体培养基中活化和扩大培养,再接种于灭菌的液体LB培养基中，37°C摇床培养至菌体增殖，培养9〜10h，将培养液8000rpm/min离心，收集沉淀的菌体。
用磷酸盐缓冲液溶解溶壁微球菌，调至OD5。
调至吸光度值范围在0.70±0.05，于25C水浴中保温，用于溶菌酶酶比活的检测。
溶菌酶纯品酶液
取溶菌酶标准工作液以适量1/15mol/LpH=6.2磷酸盐缓冲液稀释，联合专家
委员会〔JECFA发布产品标准中溶菌酶检测方法的检测。
溶菌酶活力测定
试样反响体系
参加物
测定液/mL
空白液/mL
菌液
3.0
3.0
溶菌酶溶液
0.15
0
磷酸盐缓冲液
0
0.15
量取25C的3.0mL菌悬液于10mm石英比色皿中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数〔A0〕,量取25C的待测酶液0.15mL,参加到上述比色皿中，开始计时，分别记录15s、75s反响体系的吸光度A。
同上法操作，做空白试验，分别记录15s、75s反响体系的吸光度A。
根据酶活力定义，溶菌酶的活力按照以下公式计算：
式中:
:
溶菌酶酶活力，单位为单位每毫克〔U/mg〕
:
每分钟测定的吸光度之差
C:
溶菌酶浓度
按照溶菌酶酶活力测定方法一一比浊法，分别对待测酶液的酶活力进行测定
升级会员 