分离实验报告.docx

1、分离实验报告溶菌酶的别离纯化姓名：杨兴旭 学号： 060516211、实验目的(1)利用D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化溶菌酶( 2) 进行溶菌酶活力和比活力的测定(比浊法)( 3) 进行溶菌酶纯度检测( SDS-PAG)E、实验原理溶菌酶(lysozyme,简称LZM)是由英国弗莱明在1922年发现的，它 是一种有效的抗菌剂，全称为1,4- B -N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁 酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸 52和谷氨酸 35，是一种糖苷水解 酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG与N-乙酰胞壁酸(NAM 间的B -1，4糖苷键，相对分子质量14700 Da

2、,由129氨基酸残基构成，由 于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达 10.8 左右，最适温度A 1 %为50 C,其最适PH在67左右。在280 nm的消光系数A 1cm 为13.0。 该酶活性可被一些金属离子 CiT Fe2+、Zn2+ (10-510-3M)以及N-乙酰葡萄 糖胺所抑制，能被Mg+、Cf (10-510-3M)、NaCl所激活。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋 (含量约为 2 %4 %)和哺 乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本 实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并别离纯化。大多数从蛋清中提取别离得到的溶菌酶，是一种碱性球

3、蛋白有 4 对二 硫键维持酶构型，其分子由 18 种共 129 个氨基酸残基组成， 分子量为 14000 Da左右。其纯品为白色、微黄色或黄色的晶体或无定型粉末，无嗅，易溶解 于水，不溶于丙酮、乙醚等。等电点 PI 为 10.711.0 。溶菌酶非常稳定，在 pH 值为 1.211.3 内剧烈变化时，其结构几乎不 变。在酸性条件下，热稳定性很好。pH值在47时，100 C处理1 min， 仍保存较好的活力。但在碱性条件下，尤其当 pH升至9时，溶菌酶耐热性 较差，易变性。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性， 在中性条件下溶菌酶 带正电荷，因此在别离制备时，先采用等电点法粗别离，D152

4、大孔弱酸性阳 离子交换树脂提取纯化溶菌酶，分光光度法测定酶活性及比活力，最后用 SDS-PAG鉴定。三、实验材料、试剂及仪器鸡蛋假设干、D152大孔弱酸性阳离子交换树脂色谱柱、烧杯(100 mL,250 mL，1000 mL)、锥形瓶(100 mL)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒(100 mL,250 mL，1000 mL)、10 mL离心管、1.5 mLEp管、高速离心机、冰箱、 SDS-PAG电泳设备、电炉、紫外分光光度计固体氯化钠(NaCI);固体硫酸铵(NH4)2SQ;固体磷酸氢二钠(NaHPG 12HC); 固体磷酸二氢钠(NaHPO 2H2O);固体磷酸钠(NaPQ);乙

5、醇；蒸馏水； 甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮 ；溶菌酶标准品；N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂； 聚乙二醇-20000、两性电解质试剂配制：30%丙烯酰胺贮存液： 准确称取 29.2g 丙稀酰胺、 0.8 g N,N -甲叉双丙稀 酰胺，加少量蒸馏水溶解后定再容至 100mL过滤，放纵于4C冰箱保存。别离胶缓冲液( 1.5 moI/L pH=8.8 Tris-HCI 缓冲液)：取 18.2 g Tris ， 加少量蒸馏水溶解，用1 moI/L盐酸调节pH至8.8 (约48 ml)后，定容至100 mL。浓缩胶缓冲液( 0

6、.5 mol/L pH=6.8 Tris-HCl 缓冲液)：取6.0 g Tris ，加少量蒸馏水溶解。用1 moI/L盐酸调节pH至6.8 (约48 mL)后，定容至100 mL4%&缩胶(10 mL) : 0.5moI/L pH=6.8 Tris-HCI 2.5mL,胶贮液 1.3 mL，10%SDS 100 uI ， TEMED 10 uI， 10% AP 100 uI ，双蒸水 6.1 mL。12%别离胶(20 mL)： 1.5 moI/L pH=8.8 Tris-HCI 5 mL, 胶贮液 8 mL， 10 %SDS 200 uI， TEMED 8 uI， 10 % AP 200 u

7、I ，双蒸水 6.6 mL。pH =8.3 Tris-GIy 电泳缓冲液：Tris6 g、glycine 28.8 g 、SDS 1 g，力卩少量蒸馏水溶解，pH调至8.3，定容至1 L 0考马斯亮蓝染色液：1.25 g考马斯亮蓝R250 450 mL甲醇：水1:1 50 mL冰醋酸。脱色液：450 mL甲醇：水1： 1、50 mL冰醋酸。0.02 mol/L PBSpH=8.0:取 5.3mL 0.2M NaHPQ溶液，94.7mL 0.2 MNaHPQ 溶液，加蒸馏水稀释至1000 mL，混匀四、实验方法溶菌酶提取纯化：D152大孔弱酸性阳离子交换树脂提取纯化离子交换法是根据溶液中被别离物

8、质的带电差异， 而与离子交换剂之间结合 力的大小差异， 到达别离纯化目的的操作技术。 由于该方法具有良好的生物相容 性、简便、高效、且可自动化连续操作等优点，是溶菌酶生产的常用方法。溶菌 酶为碱性蛋白质，等电点为10.711.0，蛋清中其他主要蛋白质等电点均低于 6.0，因此根据与其他蛋白质等电点的差异， 选用离子交换法进行溶菌酶的提取。 溶菌酶等电点为较高， 在蛋清中带正电荷， 因此应选用阳离子交换树脂进行吸附。强酸性阳离子交换树脂的主要交换基团为 -SQH,由于强阳离子交换剂与酶 作用较强，在洗脱过程中，溶菌酶难以洗脱，且易导致蛋白质的变性。溶菌酶活力比活力测定：溶菌酶活力和比活力的测定比

9、浊法比活力测定： 采用分光光度法。溶菌酶在 281nm 波长处有最大吸收峰，制 备不同浓度的溶菌酶溶液，在 281nm 波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，可 求出标准曲线回归方程。 溶菌酶酶活力测定方法采用比浊法。溶菌酶能水解溶壁微球菌，使菌悬液在 450nm波长处的吸光度下降。以此测定溶菌酶酶活力。酶活力定义：在25 C下，pH值6.2时，每分钟溶壁微球菌菌悬液 0阪值下 降 0.001 为一个活力单位 U。溶菌酶纯度检测：溶菌酶纯度检测 SDS-PAGE五、实验步骤1、溶菌酶的粗提取取实验用鸡蛋破壳取蛋清置于 250 mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠 度均匀，然后用两层纱布过滤，去除脐

10、带和蛋壳。记录其体积 ViJ参加1.5倍体积的pH=8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀用冰醋酸调pH=4.7左右，充分搅拌J3500 rpm，离心 20 min弃沉淀，转移上清至烧杯中参加1倍体积的pH=8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5 mol/L NaOH调pH=8.0滤纸过滤，取清液，测量并记录体积 V2j取0.5 mL清液并参加等量甘油于1.5 mL Ep管中，制备2管，-20 C备用余下的清液分装在10 mL离心管中-20 C冻存备用。样品S蛋清的制备操作：将45个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出鸡蛋清 pH值不 得小于8，轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去

11、脐 带块，量体积约为100ml.鸡蛋清粗别离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边参加等体积的去离子水， 均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。2、溶菌酶的别离纯化D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析1 D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用 1 mol/L NaOH 搅拌浸泡并搅拌48小时，抽滤去除杂质NaOH,用蒸馏水洗至近pH=7.5,进行 抽滤，再用1 mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤除去HCI ,用蒸馏水清洗致近pH=5.5，保持过夜，如果pH值不低于5.0，抽滤除去 HCI,用2 mol/L NaOH

12、处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液， 加 pH=6.5 0.02 moI/L 的磷酸盐缓冲液平衡树脂。2装柱：取直径1.6 cm，长度为30 cm的层析柱，自顶部注入经处理的上 述树脂悬浮液，然后关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再参加一 些树脂，至树脂沉积至1520 cm高度即可。于柱子顶部继续参加 pH=6.5, 0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液 pH 为 6.5 为止，关闭柱子出口，保持 液面高出树脂外表 1 cm 左右。 3上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，翻开出口使其缓慢 流入柱内，流速为 1 ml/min 。 4洗脱：用柱

13、平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分 光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含 1.0 mol/L NaCl 的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。 5聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以 聚乙二醇， 容器加盖， 酶液中的水份很快就被透析膜外的聚乙二醇所吸收， 当浓 缩到 5 mL 左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。 6透析除盐：蒸馏水透析除盐 24 小时。3、溶菌酶活力测定 1酶液配制：准确称取溶菌酶样品 5 mg, 用 0.1 mol/L, pH=6.2 磷酸缓冲液 配成1 mg

14、/ml的酶液，再将配制酶液稀释成 50用/ml.2 底物配制：取干菌粉5 mg加上述缓冲液少许，在研钵中或匀浆器中研 磨 2 分钟，倾出，稀释到 1525 ml ，此时在比色上的吸光度最好在 0.50.7 范围内。3 活力测定：先将酶和底物分别放入 25OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物 悬浮液4 mL放入比色杯中，在450 nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸 取样品液0.2 mL 相当于10酶，每隔30 s读1次吸光度，到90 s时共计 下四个读数。5活力单位的定义是：在25 C, pH=6.2,波长为450 nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位酶的活力单位数=AA45n

15、m/t X 0.001比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质【实验结果】体积 总蛋白 总活力 比活力步骤工程制备蛋清溶菌酶别离D152树脂柱层析Sephadex G50 层析4、溶菌酶纯度鉴定与分子量测定1蛋白样品的处理取200 Z上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，参加 200卩L的2X上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在 100 C沸水浴中加热35 min，取出后10000 r/min 离心10 min，取上清待用。1电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。试样格梳子临用前 用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。2按比例配好别离胶，用移液管快速参加，大约5 cm左右，

16、之后加少许蒸馏水， 静置30分钟。凝胶配制过程要迅速,催化剂TEME要在注胶前再参加,否那么凝 结无法注胶.注胶过程最好一次性完成，防止产生气泡。水封的目的是为了使别离 胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。3倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳参加浓缩胶 直至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置。样梳需要一次平稳插入，梳口处不 得有气泡,梳底需水平。4拔出样梳后，在上槽内参加缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。要使 锯齿孔内的气泡全部排出，否那么会影响加样的效果.5加样，从第一个开始按已编排好的顺序依次参加蛋白 Marker和相应体积的

17、样 品。其中Marker和样品加样量均为20卩L。微量移液器不可过低,以防刺破胶 体,也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为防止边缘效应，最好选用中部的孔注 样。6电泳槽中参加缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在 20 mA,当进入别离胶后改为30 mA溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。7凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，参加染色液， 42 C染色40 min左右。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。8脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区 带清晰。9将凝胶扫描分析，求出溶菌酶的

18、相对分子质量。试剂15%分 离胶10m L5%浓缩胶(4m L)H2O2.32.730灿烯酰胺溶液5.00.671.5 M Tris-HCI(pH=8.8)2.51.5M Tris-HCl(pH=6.8)0.510% SDS0.10.0410% AP0.10.04TEMED0.0040.004六、考前须知1.等电点沉淀后利用离心的方法，要尽量除去沉淀;2.调节pH时要防止局部过酸；3.提取过程中尽量防止泡沫的产生4.加样蛋白浓度低于20 mg/mL,上样的体积小于柱体积的1/3。5.在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。过大，会使填料压 缩紧密,导致流速过低,层析柱有可能堵塞而实验失败,流

19、速过小,实验时 间过长，引起酶的活性变化。对于 CM-SepharoseFF填料，在最适宜流速在 100cm/h 以下。因此,在我们的实验中,控制流速为 2 mL/min。6.冲平过程一定不能省。因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能 从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未 结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。7.N,N-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用 时应防止其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。8.安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，防止缓冲液渗漏。9.用琼脂 糖封底及灌胶时不能有气泡， 以免电泳时影响电流的

20、通过。10.加样时样品不能超出凹形样品槽。 加样槽中不能有气泡， 如有气泡， 可用注射器针头挑除。11.实验试剂使用应当注意平安操作；做好防护及应急处理工作。溶菌酶酶活力的测定方法 二 溶菌酶标准曲线的绘制采用分光光度法：溶菌酶在 281nm 波长处有最大吸收峰，制备不同浓度的 溶菌酶溶液，在 281nm 波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，可求出标准曲线 回归方程。试剂配制0.9%氯化钠溶液：称取氯化钠 9.0g ，溶解于蒸馏水中，定容至 1000m L 。 溶菌酶标准工作液：准确称取溶菌酶标准品 50mg,以浓度为0.9%的Na Cl溶液溶解并定容至100m L,得到浓度为500卩g/m L

21、的溶菌酶标准工作液。 标准曲线的绘制分别吸取溶菌酶标准工作液 0.5m L 、1.0m L、1.5m L、2.0m L、2.5m L、 3.0m L、3.5m L、4.0m L 于 25m L 容量瓶中,以 0.9%氯化钠溶液稀释并定容, 混匀。用 10mm 石英比色皿比色, 以 0.9%氯化钠溶液为参比溶液, 在波长 281nm 处依次测定个标准工作液的吸光度, 以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标, 吸光度 为纵坐标绘制标准曲线,并求出标准曲线方程。溶菌酶酶活力的测定溶菌酶酶活力测定方法采用比浊法。 溶菌酶能水解溶壁微球菌, 使菌悬液在 450nm波长处的吸光度下降。以此测定溶菌酶酶活力。酶活力

22、定义：在25r下，pH值6.2时，每分钟溶壁微球菌菌悬液 OD450 值下降 0.001 为一个活力单位 U。试剂配制与菌液制备0.2mol/L p H=6.2 磷酸盐缓冲液：准确称取 NaHPQ 2HO 31.20g，用蒸 馏水溶解并定容至1000mL;准确称取NaHPO 12HO 71.63g，以蒸馏水溶解并 定容至1000 mL取NaHPO溶液815 mL与NazHPO溶液185 mL混合，混匀即 可。0.067mol/L p H=6.2 磷酸盐缓冲液：准确称取 NHPO 2HO10.40g，用蒸 馏水溶解并定容至1000 mL;准确称取NstHPO 12HO 23.88g，用蒸馏水溶解

23、并 定容至1000 mL。取NqHPO溶液800 mL与NaHPO溶液200 mL混合，混匀即可。 溶壁微球菌菌液制备：将溶壁微球菌接种于灭菌的固体培养基中活化和扩大培 养,再接种于灭菌的液体LB培养基中，37C摇床培养至菌体增殖，培养910h， 将培养液 8000rpm/min 离心，收集沉淀的菌体。用磷酸盐缓冲液溶解溶壁微球 菌，调至OD5。调至吸光度值范围在0.70 0.05，于25C水浴中保温，用于溶菌 酶酶比活的检测。溶菌酶纯品酶液取溶菌酶标准工作液以适量1/15 mol/L pH=6.2 磷酸盐缓冲液稀释，联合专家委员会JECFA发布产品标准中溶菌酶检测方法的检测。溶菌酶活力测定试样反响体系参加物测定液/mL空白液/mL菌液3.03.0溶菌酶溶液0.150磷酸盐缓冲液00.15量取25C的3.0mL菌悬液于10mm石英比色皿中，在450nm的波长处测定吸 收度，作为零秒的读数A0,量取25C的待测酶液0.15m L,参加到上述比色 皿中，开始计时，分别记录15s、75 s反响体系的吸光度 A。同上法操作，做 空白试验，分别记录15s、75 s反响体系的吸光度A。根据酶活力定义，溶菌 酶的活力按照以下公式计算：式中:溶菌酶酶活力，单位为单位每毫克 U/mg:每分钟测定的吸光度之差C:溶菌酶浓度按照溶菌酶酶活力测定方法一一比浊法，分别对待测酶液的酶活力进行测定