层析填料Capto MMC的使用说明Word格式文档下载.docx
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2CaptoMMC的特性
CaptoMMC具有多种官能团的配体，多种作用方式的官能团使配体具有不同于传统离子交换剂的选择性，且在高盐条件下仍具有结合蛋白质的活性。
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CaptoMMC与大分子间存在多种作用方式，其中最显著就是离子作用，氢键和疏水作用。
CaptoMMC是为了提高介质在捕获和中间纯化步骤中的速度和通量而设计的。
通过提高高盐浓度下的容量和低反压条件下的流速，而减短生产周期和提供生产力。
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该媒介以高流速的琼脂糖为基质，典型的大规模柱子（直径为1m，柱床高度为20cm）在顶板压力低于3bar时流速为600cm/h或者更高。
高交联度的琼脂糖基质提供了很高的物理和化学稳定性。
容量、洗脱行为和压力/流速等特性不受层析过程常用溶液的影响。
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CaptoMMC和琼脂糖6快速的压力-流速特性比较，工作条件
3方法设计和优化
设计和优化生物大分子分离方法的目的是确定实验条件，在尽可能短的时间和尽可能高的产品回收率的条件下提高目的分子的最大吸附量。
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在结合蛋白时，CaptoMMC的作用类似于弱阳离子交换剂。
因为允许在高电导率条件下吸附蛋白，所以可能不需要为了提高填料的结合能力而去筛选最优化的加载电导率。
然而加载电导率可能会影响吸附选择性。
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CaptoMMC在高电导率条件下对蛋白的有效捕获的特性在许多情况下会限制提高盐浓度以洗脱蛋白质的方法的使用。
通常可以通过联合改变pH、缓冲液浓度和洗脱盐而摸索到最优的洗脱条件。
为了建立最优的洗脱方案，实验设计是一种研究多种参数对蛋白回收率的影响的有效方法，实验设计方法的例子如应用说明11-0035-48所述，或者可以应用最优化的梯度洗脱方法。
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4建议的纯化方案
使培养液的pH比目标蛋白的等电点低0.5~2.0个pH。
需要根据具体的目标分子确定精确的pH。
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使用与培养液相同pH的起始缓冲液平衡柱子；
上样；
用起始缓冲液洗去未结合的样品；
按照以下方式洗脱目标蛋白：
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4.1通过使用低于目标蛋白等电点0.5、1.5、2.5个pH的缓冲液或者使用pH梯度缓冲液筛选最优洗脱pH。
如果需要可以将目标蛋白开始洗脱的pH作为基础进行优化。
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4.2在步骤1确定的pH条件下，使用0.5、1.0、1.5M的盐溶液筛选洗脱的盐浓度。
4.3如果需要进一步优化，可以提高缓冲盐的浓度，如从50Mm~250mM。
4.4如果目标蛋白仍然以级分的不对称峰洗脱，可以更换洗脱盐，如NaCl改为NH4CL。
4.5尿素和有机修饰剂等添加剂某些蛋白的回收率。
5通量的优化
优化方案主要需要考虑产品回收率和吞吐量之间的关系。
使用实际给料过程的前沿分析检测对目标蛋白的动态结合能力。
由于在样本应用程序中，动态结合能力是流速的函数，突破能力必须通过各种不同的停留时间来定义（流速），以显示最佳的吞吐量水平。
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6放大
在实验室规模的方法得到优化之后，可以按比例进行放大。
6.1根据载量的需要选择柱床体积。
6.2选择一个直径合适的柱子使柱床高度能达到10~45cm之间，为了充分利用CaptoMMC，在大规模生产时我们建议柱床的高度为20cm或更高。
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6.3在进行放大实验时，在增加柱子直径和体积流量的同时通常都会保持柱床高度和流速恒定。
然而，在优化方案时会优先选择小的柱体积，这是为了节省样品和缓冲液，如优化动态结合能力等参数时会选择比最终高度更低的柱子高度。
只要保留时间是恒定的，目标分子的结合能力就保持不变。
其它的因素如关键杂质的清洗会随着柱床高度的改变而改变，需要在最终柱床高度进行验证。
滞留时间近似等于柱床高度与流速的比值。
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7实验室规模柱子的填装
以下是关于实验室规模柱子的填装的说明：
10cm柱床高度的Tricorn5/100,
Tricorn10/100,XK16/20；
40cm的XK16/70。
需要更详细的了解Tricorn的填装，可以查看相关资料。
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7.1填装Tricorn5/100and10/100
7.1.1材料：
CaptoMMC；
玻璃过滤漏斗；
塑料勺；
过滤瓶；
量筒；
20%乙醇
媒介的量：
所需的CaptoMMC可以通过以下公式计算：
柱子的横截面积（cm2）×
柱床高度（cm）×
压缩因子（媒介的沉降体积/填装后媒介的体积）。
压缩因子近似等于1.15。
例如：
柱床高度为10cm的Tricorn5/100需要的沉降媒介体积为：
0.78×
10×
1.15=9ml。
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准备悬浮液：
悬浮液的体积等于沉降媒介体积除以悬浮液的浓度。
填装的时候，悬浮液的浓度应该达到60%。
平衡所有的物料至室温，将玻璃过滤漏斗安装到过滤瓶上。
将填料倾倒至漏斗并用20%乙醇洗涤（每1ml填料使用6ml的20%乙醇）。
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将沉降的填料转移至烧杯加入适量的20%的乙醇。
为了最终得到一个准确的柱床高度，悬浮液过夜静置或3000rpm离心3min后，使用量筒进行测量，度数前应等待5min。
也可以先使用过量的填料装住然后再移去多余的填料。
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7.1.2填装步骤
1.
8装柱效果的评价
通过测定柱效来检查装柱的质量。
在装柱和柱子的工作寿命之间应定期测定柱效，特别是柱子的分离性能降低的时候。
柱子效果的最好的表达方式是在同等高度条件下的理论塔板（HEPT）和非对称因子（As），使用1%的丙酮溶液作为样品，可以很容易的检测出以上两者的值。
氯化钠也可以作为检测物质，使用2M、0.5M的氯化钠水溶液作为洗脱液。
注解：
计算出来的塔板数会随着检测条件的变化而变化，它只能作为一个参考值。
保持测试条件和设备的稳定对于结果的可比性是非常重要的。
溶质、溶剂、洗脱液、上样体积、流速、液体通路、温度等的变化都会对结果造成影响。
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为了达到最佳的效果，上样体积应为柱床最大体积的2.5%，流速应为15~30cm/h。
如果定义一个与柱效相关的验收极限，柱子的理论塔板数可以作为柱子使用的验收标准。
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理论塔板（HETP）和不对称因子（As）的测量方法：
HETP=L/NN=5.54×
（VR/Wh）2
L为柱床高度（cm）
N为理论塔板数
VR为从进样开始至峰最高值的洗脱体积
Wh为1/2最高峰处的峰宽
折合板高常作为柱效比较的参数。
可通过以下公式计算：
HETP/d
d为填料的粒径，指导性原则：
<
3通常都可以接受。
吸收峰应该是对称，不对称因子应尽可能接近与1（08~1.5之间均可以接受）。
峰形的改变常常是柱床发生改变的第一个迹象。
不对称因子的计算方法：
AS=b/a
a为10%峰高处的半峰宽（前）
b为10%峰高处的半峰宽（后）。
以丙酮为标志物，通过紫外检测的计算HETP和AS的经典方法，如下图所示。
9保养
为了能使CaptoMMC在工作寿命期间保持最好的分离效果，按以下步骤进行保养。
9.1平衡
在装柱之后或进行层析操作之前，使用至少5个柱床体积的起始缓冲液冲洗，或者直到流穿的电导和pH值保持不变。
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9.2再生
每次分离后，用高离子强度的溶液洗脱可逆性的结合物（例如2MNaCL的缓冲液），此外将pH调至10~11。
使用至少5个柱床体积的起始缓冲液冲洗，或者直到流穿的电导和pH值保持不变。
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9.3原位清洗
原位清洗是指除去柱子再生之后仍残留的脂肪、内毒素、沉淀或变性蛋白质等污渍。
在用粗料液上样的时候常会带来这样的杂质。
定期的原位清洗能够防止污渍在柱床的堆积，还可以保持CaptoMMC的载量、流速和常规性能。
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应根据污渍类型的不同设置特定的原位清洗步骤。
原位清洗的频率取决于环境和料液的情况，但是对于捕获来说，建议每次循环后都进行一次原位清洗。
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9.4消毒
为了除去柱子中的微生物，建议使用0.5~1.0MNaOH洗涤1h。
原位清洗步骤中的针对沉淀和疏水性结合的蛋白或脂蛋白所采取的步骤能有有效去除清污和消毒。
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9.5储存
将不使用的填料在4~30oC储存于容器中，确保容器的密闭的。
填装的柱子应使用20%乙醇平衡以防止细菌的生长。
储存的填料在使用之前应先使用至少五个柱床体积的缓冲液平衡。
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