发酵工程复习整理重点Word格式.docx

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细胞生长的速率、各种基质组分消耗的速率、代谢产物的生成速率。

三、比生长速率

当X2=2X1时，此式可求得△t=td（细胞浓度倍增时间）：

td=ln2/μ=0.693/μ

四生物反应器的类型

五、体积传氧系数的测定方法

氧气吸收的体积传递系数，可采用下列几种方

法测定：

①直接测量法

②亚硫酸盐氧化法

③动态法

六、放大原则：

通气发酵罐的放大设计：

（一）几何相似放大

（二）以单位体积液体中搅拌功率P0/VL相等的准则进行反应器放大

（三）以体积溶氧系数KLa相等为基准的放大法

（四）以搅拌叶尖端线速度相等的准则进行反应器放大

（五）混合时间相同的准则

七、生物反应器的检测及控制

设定参数

1．压强2．温度3．通气量4．液面5．搅拌转速与搅拌功率6．泡沫高度7．培养基流加速度8．冷却介质流量与速度9．培养基质浓度和产物浓度

状态参数1．黏度（或表观黏度）2．pH3．溶氧浓度和氧化还原电位4．发酵液中溶解CO2浓度5．细胞浓度6．菌体形态

第二章、动物细胞大规模培养和专用生物反应器

一、体外培养动物细胞的生长增殖过程

1.原代培养期:

从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。

这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。

（由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

2.传代期：

从原代培养的细胞一经传代后便称细胞系。

细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。

3.衰退期：

细胞增殖缓慢或不增殖。

细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。

二、培养细胞生长的条件

1.细胞的营养需要

2.细胞的生存环境

温度:

37℃、O2、CO2:

5%

CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

pH:

7.2-7.4

渗透压

3.无污染

4.无毒

三培养基：

培养基（培养液）是维持细胞体外生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

四、无血清培养基优点：

①提高重复性②减少微生物污染③供应充足稳定④产品易纯化

⑤避免血清因素对细胞的毒性⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰

五、补充因子又可归类为必需补充因子和特殊补充因子。

完全培养基的组成

1.基础培养基80％一95％

2.血清5％一20％

3.青、链霉素各100U／ml

六传代细胞培养

根据细胞生长的特点，传代细胞培养有3种：

1．悬浮培养

2．贴壁培养

3.固定化培养

七每代贴附生长细胞的生长过程

游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期、停止期（平台期）

细胞计数：

1.细胞计数板2.MTT比色法

八冻存和复苏的原则：

慢冻快融

常用的低温保护剂是DMSO

九常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。

十吸附法

l1）转瓶法

l2）微载体法

l3）中空纤维法

包埋法：

包埋法根据载体与方法不同，亦有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种

十一、细胞大规模培养的操作方式

培养方式分为：

Ø

分批式

流加式

半连续式

连续式

灌注式

灌注培养

灌注培养：

是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养液从反应器一头不断加入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。

特点：

高密度培养动物细胞。

十二动物细胞大规模培养反应器

⒈搅拌式生物反应器

⒉气升式生物反应器

⒊中空纤维式生物反应器

⒋透析袋或膜式生物反应器

⒌固定床或流化床式生物反应器

1、通气搅拌式细胞培养反应器

反应器的优缺点

优点：

避免向培养基直接通气时气泡损伤细胞，没有移动部件，密封好，便于放大。

缺点：

氧传递系数小，气路系统不能就地灭菌。

2、气升式生物反应器

优点:

器内湍流温和均匀剪切力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。

3、中空纤维细胞培养反应器

优点

培养器体积小，细胞密度高；

产物纯度高；

自动化程度高，细胞生长周期长。

缺点:

价格高

第二篇目标产品的分离与纯化

1、微生物发酵液的特性可归纳为：

①发酵产物浓度较低，大多为1%~10%，悬浮液中大部分是水；

②悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；

③固体粒子可压缩性大；

④液相粘度大；

⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。

2、发酵液预处理的五个方法:

v一、降低液体粘度加水稀释法和加热法

v二、调整Ph

v三、凝聚与絮凝

v四、加入助滤剂

v五、加入反应剂

3、胶粒保持分散状态的原因

1、扩散双电层的结构：

一旦由于布朗（Brown）运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥作用，阻止了粒子的聚集。

ζ电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大。

2、水化层：

由于胶粒表面的水化作用，形成了水化层，也能阻碍直接聚集。

水化膜主要是伴随胶粒带电而引起，一旦ζ电位降低或消失，水化层也会随之减弱或消失。

3、凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。

絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如－COOH）或阳离子（如－NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。

它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。

当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。

对絮凝剂的化学结构一般有下列两方面的要求:

一方面要求其分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合；

另一方面要求必须具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。

4、杂蛋白质的除去

（1）沉淀法

（2）变性法（3）吸附法

5、发酵液固液分离的主要是离心分离和过滤。

6、根据过滤机理的不同，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤两种:

肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分

细胞破碎方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。

4、化学渗透法

（1）酸、碱处理法

（1）酸、碱处理法

（2）表面活性剂

（3）有机溶剂

（4）EDTA螯合剂处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用

v化学渗透法与机械法相比具有如下优点：

v①对产物释出具有一定的选择性。

化学试剂处理能使一些分子量小的溶质（如多肽和小分子的酶蛋白）透过，而分子量大的物质（如核酸）则被阻滞在胞内。

v②细胞外形保持完整；

碎片少，有利于后续分离。

v③核酸释出量少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。

v5、酶溶法（enzymaticlysis）

v

（1）外加酶法

v

（2）自溶法

选择破碎方法的依据：

◆细胞处理量；

◆细胞壁强度和结构（高聚物交联程度、种类和壁厚度）；

◆目标产物对破碎条件的敏感性；

◆破碎程度；

◆目标产物的选择性释放选择性释放目标产物，使其他物质尽量少地释放出来，并尽量降低细胞的破碎程度，对下游分离纯化有利。

选择性释放目标产物的一般原则

⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围

（2）机械破碎法和化学法并用可使操作条件更温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。

v测定破碎率的方法。

v1、直接测定法

v2、目的产物测定法

v3、导电率测定法

（二）细胞破碎技术研究的发展方向

v1、多种破碎方法相结合

v2、与上游相结合

3、与下游过程结合

包含体复性

路线1的特点

特点:

是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。

摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。

从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。

要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。

路线2的特点

路线

（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。

◆优点：

封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。

◆缺点：

细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；

而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。

2）目标蛋白的变性溶解

常用变性剂：

▲5-8mol/L盐酸胍或6-8mol/L尿素,

3）目标蛋白的复性

复性方法：

●稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。

●膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。

●层析法－凝胶层析，高效疏水层析

v与前面的两种传统复性方法相比较（色谱复性特点）：

v1、由于色谱介质对变性蛋白质的作用可明显的减少变性蛋白质分子在脱离变性剂后的分子聚集，从而减少沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

v2、能使复性和纯化同时进行；

v3、便于回收变性剂，以降低废水处理成本。

蛋白质复性影响因素：

◆目标蛋白浓度；

◆变性剂浓度；

◆pH和离子强度；

◆氧化还原条件。

还原剂：

二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；

氧化剂：

氧化型谷胱甘肽;

碱性下通空气。

v复性效果的检测：

v根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

v1、凝胶电泳：

一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

v2、光谱学方法：

可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

v3、色谱方法：

如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

v4、生物学活性及比活测定：

一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

v5、黏度和浊度测定：

复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

v6、免疫学方法：

如ELISA、westernblot等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

岁碎片出去的五个方法：

v一、离心沉降

v二、微孔膜过滤

v三、双水相萃取

v四、泡沫分离法

v五、避开固液分离的探索——扩张床吸附

v切向流过滤

v在一般过滤中，滤液的流动方向与滤饼基本垂直，称为封头过滤（Dead-EndFiltration）。

v切向流过滤（C