Notch受体的配体Deltalike1蛋白表达 纯化及其性能研究.docx

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Notch受体的配体Deltalike1蛋白表达纯化及其性能研究

西北大学硕上学位论文

Notch受体的配体Delta．1ikel蛋白表达、纯化及其性能研究

摘要

在胚胎时期和出生后生长时期，Notch信号通道在细胞的增殖、凋亡等方面都起着重要作用，而成为治疗人类疾病（如癌症）的～种潜在方法。

由于Notch信号具有促进造血干细胞自我更新，抑制分化的功能，所以激活N0tch信号有利于干细胞的扩增。

目前，在哺乳动物中已发现5种_Notch配体（Jaggedl、Jagged

2、Del诅_likel、Del协Iike3和De【诅一like41。

其中Hum姐Del协1ikel（简称hDlll）

由737个氨基酸组成，是单次跨膜蛋白，其胞外段中有1个DSL基序和8个EGF样结构域。

可溶性的人Delta-1具有延迟鼠类造血祖细胞分化和促进早期祖细胞扩增的功能。

为了更加深入地研究可溶性人De】ta-iikel（1Dlll）片段，进行造血干细胞移植的体外扩增实验，我们利用重组uNA技术和液相色谱技术在体外进行了细胞外的两个hDlllchDlIl（127-225）和hDIIl（26乏25）】基因片段克隆、表达和复性与同时纯化的研究，所获得的结果：

舟为建立造血干细胞的体外快速大量增殖体系和开展慢性粒细胞白血病造血干细胞移植治疗提供实验支持，以期解决临床造血干细胞治疗中干细胞来源不足的困难。

正文主要包括两个部分：

1、可溶性人DeJta-Jjkel在西曲mm缸∞盯中的表达及其发酵工艺的研究

根据天然hDlll基因序列，我们设计合成了PCR引物，以人肝脏的cDNA为模板进行PCR体外扩增获得编码成熟肽的GsT．hDlll基因。

将测序正确的hDlll【hDlll（127—225）】基因片段与谷胱甘肽一s一转移酶（GST）融合于pGEx4T一1

表达载体，重组质粒pGEX4T．1GSthDlll转化入西c矗erfc觚2c口ZfDH5旺中，经

IPTG诱导在髓c^Pr配^抽c。

，f中获得了表达，其表达的蛋白主要以包涵体形式存在。

并在此基础上，进一步对摇瓶培养中西c^F，fc厅妇∞，f生长和GsT-hDlll表达的影响因素（培养基、碳源、温度、pH、溶氧等）进行了优化筛选。

结果确定M9为本实验基础培养基，以每50mLM9培养基／250mL摇瓶，初始pH7．2，甘油为碳源，转速210r／min，在30。

c培养至0D600达到0．7—1．O时，加入IPTG（O．6

咖l／U诱导表达5h时，目的蛋白的表达量为42．9％。

菌体经5L发酵罐培养，

ll

西北大学硕l。

学位论文

其结果显示：

流加发酵方式培养优于分批发酵，前者的产量为24．O∥L细胞湿重。

2、可溶性人Delta．Iikel包涵体回收及其液相色谱复性与同时纯化工艺的研究

将5L发酵罐获得的菌体重悬于配制好的缓冲液中，进行超声破碎、多次洗涤后，将包涵体溶解于强变性剂（8moI／L脲或6—7mol／L盐酸胍），利用蛋白折叠液相色谱技术（亲和色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱和离子交换色谱）对溶解的包涵体分别进行复性并同时纯化。

结果：

（1）经亲和色谱柱其纯度达到97％，蛋白质量回收率为89％；

（2）采用改进的脲梯度SEC法复性与同时纯化GST．hDIll，可使蛋白质量回收率由47％提高到62％，纯度也由90％提高到95％，将脲梯度纯化后样品进一步经反相液相色谱其目标蛋白纯度可达到99％；（3）初步利用HPHIC和腰c进行GsT_hDllI融合蛋白的复性与同时纯化的结果显示，通过进一步进行其色谱条件优化才能有可能提高纯化效率；（4）经

SDS．PAGE、MALDI．TOF确认GsT_hDlll的分子量为39kD，与预期的结果一致，其生物活性实验证实制备的GST-hDlll融合蛋白具有刺激Notch受体的作用。

关键词：

Notch受体，谷胱甘肽．s一转移酶．人Delta_likel融合蛋白，大肠杆菌，

包涵体，蛋白折叠液相色谱，复性与同时纯化。

I¨

西北大学顾十学位论文

Expression，purificationandcharacteristicsofatruncatedhumanDelta—likel，aligandofNotchreceptors

Abstract

1heNotchsigIlalingpathwayplaysapivo伽roleinprolif宅ration，ap叩tosis，andsooninbomc柏曲ryollic姐dpos协ataldeVelopmem，肌disapoteI城altller印eutictargetfbrhumalldiseasessuch弱callc瓯

Notchisaf砌lyoftypeItr黜mernbraneproteinsthatincludesfollrm锄bers

inmousea11dmaIl（Notchl-4）．FiveNotchligall出havebeenidentifiedinm锄mals，includingJaggedl，2，aIldDelta-likel，3，4．Notch1培andsarealsotypeI把m锄1enlbraneproteills，withsophjsticatedsmlctIlralmotifsincludinganN—te锄in“

DSLmotif廿latisessentialforNotch-binding，andvaryingmlmberofEGFlikercpeats．Theh啪姐Dena-bkel（∞111）isahomologofmeDro—so蛳1a．Delta，孤d

iscomposedof723aⅡ1inoacids，wimoncDSL觚deightEGF诎er印ea乜．111ese

stnlctIlralpropertieg，嬲weⅡ够也ecomplicatedi11仃acellular拓瓶ckingpamwayduringsynmesis，havemade“di伍culttomallufactureNotchrec印torsor1igaEldsinei恤erelll（aryodccellsor凸曲折幽缸∞厅，anhou曲productionofthesemolecules

hasbeen乒eatlydesiredduetomeirmerapeuticpotentialsThemesisi11cludestwopans嬲follows：

1．Expressionandfe珊entationofasolublehumaⅡDelta-likelproteiⅡiⅡ

Escher证hi口eo髓

ToexpresshDIllinD如盯衍五血∞，f，wc锄plifiedtheN-tenIlinalsequenceof

hDlll丘Dmah岫ancDNAlibmrybyPCRandconstmctedtheGST—hDlllgene，whichwassuccessfullyexpresseditl上裔c^盯f如地cD疗．Thee行色ctsofcultllremedia，

carbonsource，culturetemperature，pH，anddissoIVedoxygen，onmeFowthof西幽Pri幽mc以andmeexpressionofGST-hDlllproteinweresystematicallyjnVesflgatedFirstly’theM9medjumwasselected矗omseveraIkjndsofbasicculture

meLlld，andwasadapledfor1hegrowthofbacteriaandtheexl）ressionofGST_hDIll

IV

西北大学硕士学位论文

Bymeasuringbacterial伊owt上1WimOD600andproteinexpwssion1lvithSDS-PAGE，meoptimumconditions、verees诅blishedasf0Ilowing：

temperanlre，30。

C；initialpH7．2；thevolumeofculturebrothinshakingnask，50mL；印proximatemtationspeed，2lOr／min；carbonsource，glycer01．InductionwasachievedbyadditionofIPTG（O．6mmol／L）埘1entheOD6000fthebact嘶areachedO．7．1．O，andtheindu“onwaspennittedfor5hat30。

CwhentheOD600ofbacteriaandexpressionof

GST_hDlllwere3．36and42．9％，reSpectivel弘BasedonmeresuItsofshakingflaskcultiVation，wecompared血ebatchculnⅡewithfcd由atehculture，andfoundthatthefed-batehculfl】rewasmuchbenera出lptedtotj】e伊owtllofbacteria卸dtheexpressionofGST．11Dllltllant11ebatchcultIlre．

2．RecoVeryaⅡdrenaturationwithsimultaneouspurificationofsolubIe

humanDelta-likeliⅡclusionbodiesbyLC

Theharvestedbacterialpastewasresuspendedinbu旋r，andlysedbysollication，followedbycentrimgation．Anerwashm＆meinclusionbodiesweredissoIVed，refoIdedandpuri行edsinluItaneousIyusingproteinf0IdingIiquidchromato黟aphy（AFC，SEC，HPHICandIEC）．

（1）ThepurifiedGST-hDlllwasmorethan97％purewi也amassrecoveryof89％usingAFC；

（2）Thepuri丘ed

GST-hDlllwas95％pureusingurea掣adiemSEC，withmassrecoveryof62％．TheelutcdGST．hDlllproteinusingurcagradicmshowedasinglepeak出erRP-HPLCaIldmep嘶fiedproducthadapur毋ofmorcthan99％；（3）Thecllromatographical

conditionsshouldbeoptimized缸thertogetbetcerp删ficationresuItsusingHPHIca11dIECforrefoldingandsimultaneouspⅥificationofGSl_-hDlll；（4）TheresultingaimproteiIlhadamolecularweightof39kDwhentlleresultwascon丘rmedwith

SDS—PAGEandMALDI—TOF，ComparedwimGST’thepurifiedGST-hDlllhadan

actiVityoftriggeringNotchreceptors，asassessedusingareponerassay．

Keywords：

Notchreceptors，GST-hDlll，上0c矗Pr耙矗缸co玩Inclusionbody（IB），

Proteinfoldingliquidchromato掣aphy（PFLC），Refbldinga11dpurmcation

V

西北大学钡L学位论文

缩略语表

英文缩写英文全名中译名

GSTGglutatlliones·transferases谷胱甘肽硫转移酶hDIllH帆aIlDeI协Iikel如sionprotein人Delta-likel融合蛋白CMLChrollicmyeloblasticleukelllia慢性粒细胞白血病

HSCHemat叩oieticstemcell造血干细胞

HSCTHematopoieticstemcelItmsplaIlt造血干细胞移植

．ation

Allo。

HSCT越logeneichematopoieticstemcell异基因造血干细胞移植

transpIalltation

IBInclusionbody包涵体

PFLCProteinfoldingliquidc11romatoF印hy蛋白折叠液相色谱

HPHICHi曲perfornlancehydrophobic高效疏水相互作用色谱

mteractionchromatogr印hy

RPLCReversed_phase1iquidchromto反相液相色谱

一伊印hy

IECIon—exch锄gechromatography离子交换色谱

SECSize-excluSionchromatogr印hy体积排阻色谱

AFCA衔nityc11romato伊aphy亲和色谱

LBLuria．bertanimedillmLB培养基

AmoAmpicillin氨苄青霉素

IPTGIsopropyl-p-D—t11iogalactoside异丙基一p—D一硫代半乳糖苷

SDS—PAGESodiumdodecylsulphatepolyacryla．十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺

minegelelectrophoresis凝胶电泳

BSABovilleserumalbmin牛血清白蛋白

ODOpticaIdensi哆光密度

西北大学学位论文知识产权声明书本人完全丫解两北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。

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本人允许论文被食阅和借阅。

本人授权两北人学可以将奉学化论文的令部或部分内容编入订关数据库进行检索，町以采J1J影印、缩印或扫描饰复制手段保存和iI：

编术学位论文。

同时授权巾幽科学技术信息研究所等机构将本学位论文收录到‘中陶学位沦文令文数据雌》或jj；它榴天教据麾。

学位论文作者签名。

五垂藿一指导教师签名：

壁茎竺：

!

1

2∞8年i月辛日2∞8年蜃月严日

西北大学学位论文独创性声明

本人声明：

所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知。

除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

学位论文作者签名：

丕蠲臣

2∞8年‘月乍日

西北大学硕上学位论文

文献综述l慢性粒细胞白血病与造血干细胞移植1．1慢性粒细胞白血病的生成与治疗

慢性粒细胞白血病（Chronicmyeloblasticleukem氓CML）是一组起源于多潜能造血干细胞异常的恶性骨髓增殖性疾病。

费城染色体（Philadelphiac11romosomePh）是CML的特征性细胞遗传学异常，90％以上的cML患者可出现Ph+染色体，约有5％的cML可出现变异的Ph染色体或复杂的染色体核型变化，尤其是在加速和急变期【1’”。

CML是由于染色体易位导致BcR-ABL融合基因的形成与表达。

因此，CML的治疗主要是消除Ph染色体，取得细胞遗传学缓解，达到延长生存期的目的。

治疗CML的药物主要有马利兰、羟基脲、干扰素及酪氨酸激酶抑制剂等。

马利兰和羟基脲只能用于cML慢性期临床症状的控制，因为这些药物很难

诱导CML获得细胞遗传学缓解，也不能阻止cML发展为加速期和急变期吼

干扰素虽然能够使50％以上的慢性期CML进入遗传学缓解，却很少能诱导CML达到分子学完全缓解，而CML患者体内残留自血病细胞的存在仍然是复发的主要原因【4】。

‘，

甲璜酸伊马替尼（商品名：

格列卫）是针对Ph染色体阳性白血病致病基因产物—BcR—ABL融合蛋白的分子靶向药物[51，是一种选择性的酪氨酸激酶抑制剂，临床效果显著，目前己被公认为CML各期的一线治疗药物{6171。

但是，随着科学家对cML发病机理的研究，发现cML的患者体内存在着可以引起cML的白血病干细胞。

该细胞有正常干细胞自我复制和分化成白血病细胞的能力，生长与生存并不完全依赖于BcR．ABL蛋白酪氨酸激酶活性01，因而利用格列卫并不能诱导其死亡。

更重要的是，患者须长年乃至终身服药，大大增加了患者的经济负担。

西北大学颁卜学位论文

1．2干细胞与造血干细胞移植干细胞是指尚未分化的细胞，是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化

能力的多潜能细胞群体11”j主要存在于早期胚胎、骨髓、脐带、胎盘和部分成年人细胞中，它分化后能够产生某一组织的一种或多种特定的细胞群体，可以被培育成肌肉、骨骼和神经等人体组织和器官。

因此，干细胞的概念已经被扩大到可以在体外进行传代并且具有分化潜能的胚胎干细胞。

其中，造血干细胞

'

（hematopoieticstemcell，Hsc）是造血前体细胞|：

12J，属于干细胞中的一种，通过不对称性有丝分裂，不断产生大量造血祖细胞，祖细胞进一步增殖和分化，补充和维持人体外周血细胞[1引。

成年人血液造血干细胞主要存在于骨髓中，约占骨髓细胞的O，05％，主要功能是通过不断分化产生各系造血祖细胞，成为造血系统新细胞的来源。

同时它们又能自我更新即自我复制，维持自身数量不变，从而能长期维持机体的正常造血机能【l”。

造血干细胞移植（HSCT）已经成为临床治疗血液病的主要手段。

HSCT是指对患者进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的Hsc经血管输注给患者，使之重建正常的造血和免疫功能f”]。

其类型可分为异体HscT、自体HscT、骨髓移植（BMT）、外周血干细胞移植（PB—SCT）以及脐血移植等几种。

很多研究证明，CML是一种对免疫治疗最敏感的疾病，异基因造血干细胞移植（A1lo．SCT）可以消除CML患者体内的残留病变。

但是，HSCT的核心技术主要是供者来源，即为患者寻找人体白细胞抗原（HLA）配型完全一致的供者。

AJlo，SCT的供者主要是有血缘关系的相关供者和无血缘关系的无关供者。

根据国际骨髓库和国内文献的资料，A110．scT供者以同胞间的相关供者为主，非血缘的供者不到50％。

在我国很长的一段时间内，非血缘无关供者的移植将成为移植的主要类型，父母与子女之间的半匹配移植也成为一种发展方向。

对不同造血干细胞来源的A1lo—ScT患者进行比较发现，非血缘和同胞间配型相合的供者的A110．SCT患者的复发率明显低于自体移植、同基因双胞胎移植及去T细胞移植的患者。

最直接的证据是Allo—sCT后复发的cML患者，输入供者淋巴细胞可使70％一90％患者再次获得完全缓解，且分子学复发患者的疗效明显

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优于遗传学和血液学的患者。

虽然脐血移植对于CML患者是一个很好的选择，但出于脐血量少，还远不

能提供足够的造血干细胞来满足众多患者移植及移植后的细胞治疗需要。

而且，对于成人患者造血恢复后，重组建的免疫系统抗白细胞作用弱，因此供者干细胞的来源仍然是限制Allo．SCT广范应用的主要原因。

造血干细胞的体外大量扩增可以解决HscT治疗中所面临的供者来源不足问题。

而大量研究表明，Notch信号途径是调控干细胞增殖分化的最重要的途径之一。

因此，造血干细胞移植相关产品人Notch配体及其相关蛋白的制备，可

更加深入的研究造血干细胞的体外增殖和№tch信号途径，也是进行造血干细胞

新方法研究的前提。

2Notch信号途径和细胞增殖分化

2．1Notch受体配体蛋白Delta．1ike1的发现

近年来，尤其在新发现了№tch在癌症和血管新生方面的功能之后，Notch信号通道作为一种治疗的目标己经引起许多研究者的关注。

许多实验证据表明，Notch信号途径在造血系统发生的多个阶段和多个环节发挥重要作用，如维持造血干／祖细胞的自我更新，决定淋巴细胞的分化，调节髓系细胞分化以及调节外周T细胞的功能等m1"。

Notch信号途径是一条在进化中高度保守，主要调控细胞增殖分化方向的信号途径㈣，广泛存在于多种生物体内。

在胚胎时期以及出生后生长时期，Notch信号通道在细胞的增殖、凋亡等方面都起着重要作用【19】。

在胚胎形成时期，目标破坏Notchl或它下游结合信号蛋白J（RBP．J）的转录因子，将导致体节组织的破环，延迟神经管的终止和破坏早期胚胎‘201。

在成年的老鼠中，有条件反射的基因破环Notchl或RBP—J蛋白，导致淋巴细胞、内皮细胞（EC）和许多其他类型干细胞产生不『F常紊乱，这暗示了这条通道对成人起着至关重要的作用口“。

一更重要的是，最近的研究表明．Notch信号的故障0ifl造成允天十牛的疾病．例如伴有皮下梗塞的大脑常染色体nq品性动脉病、自质肺J墒卡¨AIIa西IIes综合症：

I犬等．

22

嗣时皿参‘j到人类的恶性肿瘤r}=Jl2”。

例如，阻塞Notcll信号增』J玎了内皮细恺

西北大学颤七学位论吏

的增粮和肿瘤脉管的密度，同时也抑制了肿瘤生长，这主要是出于心脉管的作用较弱【241。

这一进展已经激发研究者将Notch信号作为癌症治疗的一个新目标。

2．2Delta．1ikel的作用机韦|j

由于Notch信号具有促进造血干细胞自我更新，抑制分化的功能，所以激活Notch信号有利于干细胞的扩增。

目前，在哺乳动物中已经发现有5种Notch配体，分别为Jaggedi、Jagged2、Delta'likeI、DeIta-like3和Delta—Iike4aNotch

配体与其受体都是跨膜蛋白125，261，胞外区含有数个表皮生长因子（EGF）样重复序

列及保守的D