Notch受体的配体Deltalike1蛋白表达 纯化及其性能研究.docx

1、Notch受体的配体Deltalike1蛋白表达 纯化及其性能研究西北大学硕上学位论文Notch受体的配体Delta1ikel蛋白 表达、纯化及其性能研究摘要在胚胎时期和出生后生长时期，Notch信号通道在细胞的增殖、凋亡等方面 都起着重要作用，而成为治疗人类疾病(如癌症)的种潜在方法。由于Notch 信号具有促进造血干细胞自我更新，抑制分化的功能，所以激活N0tch信号有 利于干细胞的扩增。目前，在哺乳动物中已发现5种_Notch配体(Jagged l、Jagged2、Del诅_likel、Del协Iike 3和De【诅一like41。其中Hum姐Del协1ikel(简称hDlll)由737

2、个氨基酸组成，是单次跨膜蛋白，其胞外段中有1个DSL基序和8个 EGF样结构域。可溶性的人Delta-1具有延迟鼠类造血祖细胞分化和促进早期 祖细胞扩增的功能。为了更加深入地研究可溶性人De】ta-iikel(1Dlll)片段，进 行造血干细胞移植的体外扩增实验，我们利用重组uNA技术和液相色谱技术在 体外进行了细胞外的两个hDlll chDlIl(127-225)和hDIIl(26乏25)】基因片段 克隆、表达和复性与同时纯化的研究，所获得的结果：舟为建立造血干细胞的体 外快速大量增殖体系和开展慢性粒细胞白血病造血干细胞移植治疗提供实验支 持，以期解决临床造血干细胞治疗中干细胞来源不足的困难

3、。正文主要包括两个部分：1、可溶性人DeJta-Jjkel在西曲mm缸盯中的表达及其发酵工艺的研究根据天然hDlll基因序列，我们设计合成了PCR引物，以人肝脏的cDNA 为模板进行PCR体外扩增获得编码成熟肽的GsThDlll基因。将测序正确的 hDlll【hDlll(127225)】基因片段与谷胱甘肽一s一转移酶(GST)融合于pGEx4T一1表达载体，重组质粒pGEX4T1 GSthDlll转化入西c矗erfc觚2 c口Zf DH5旺中，经IPTG诱导在髓cPr配抽c。，f中获得了表达，其表达的蛋白主要以包涵体形式存 在。并在此基础上，进一步对摇瓶培养中西cF，fc厅妇，f生长和GsT-

4、hDlll表 达的影响因素(培养基、碳源、温度、pH、溶氧等)进行了优化筛选。结果确 定M9为本实验基础培养基，以每50 mLM9培养基250 mL摇瓶，初始pH 72， 甘油为碳源，转速210rmin，在30。c培养至0D600达到071O时，加入IPTG(O6咖lU诱导表达5 h时，目的蛋白的表达量为429。菌体经5L发酵罐培养，ll西北大学硕l。学位论文其结果显示：流加发酵方式培养优于分批发酵，前者的产量为24OL细胞湿 重。2、可溶性人DeltaIikel包涵体回收及其液相色谱复性与同时纯化工艺的研究将5 L发酵罐获得的菌体重悬于配制好的缓冲液中，进行超声破碎、多次 洗涤后，将包涵体溶

5、解于强变性剂(8 moIL脲或67 molL盐酸胍)，利用蛋白 折叠液相色谱技术(亲和色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱和离子交换 色谱)对溶解的包涵体分别进行复性并同时纯化。结果：(1)经亲和色谱柱其纯 度达到97，蛋白质量回收率为89；(2)采用改进的脲梯度SEC法复性与同 时纯化GSThDIll，可使蛋白质量回收率由47提高到62，纯度也由90提 高到95，将脲梯度纯化后样品进一步经反相液相色谱其目标蛋白纯度可达到 99；(3)初步利用HPHIC和腰c进行GsT_hDllI融合蛋白的复性与同时纯化 的结果显示，通过进一步进行其色谱条件优化才能有可能提高纯化效率；(4)经SDSPAGE、

6、MALDITOF确认GsT_hDlll的分子量为39kD，与预期的结果一 致，其生物活性实验证实制备的GST-hDlll融合蛋白具有刺激Notch受体的作 用。关键词：Notch受体，谷胱甘肽s一转移酶人Delta_likel融合蛋白，大肠杆菌，包涵体，蛋白折叠液相色谱，复性与同时纯化。I西北大学顾十学位论文Expression，purification and characteristics of a truncated human Deltalikel，a ligand of Notch receptorsAbstract1he Notch sigIlaling pathway plays

7、 a pivo伽role in prolif宅ration，ap叩tosis，and so on in bom c柏曲ryollic姐d pos协atal deVelopmem，肌d is a poteI城al tller印eutic target fbr humall diseases such弱callc瓯Notch is a f砌ly of type I tr黜mernbrane proteins that includes follr m锄bersin mouse a11d maIl(Notchl-4)Five Notch ligall出have been identified in

8、m锄mals， including Jaggedl，2，aIld Delta-likel，3，4Notch 1培ands are also type I 把m锄1enlbrane proteills，with sophjsticated smlctIlral motifs including an Nte锄in“DSL motif廿lat is essential for Notch-binding，and varying mlmber of EGF like rcpeatsThe h啪姐Dena-bkel(111)is a homolog of me Droso蛳1aDelta，孤dis c

9、omposed of723 a1ino acids，wim onc DSL觚d eight EGF诎e r印ea乜111esestnlctIlral propertieg，嬲we够也e complicated i11仃acellular拓瓶cking pamway during synmesis，have made“di伍cult to mallufacture Notch rec印tors or 1igaElds in ei恤er elll(aryodc cells or凸曲折幽缸厅，anhou曲production of these moleculeshas been乒eatly desi

10、red due to meir merapeutic potentials The mesis i11cludes two pans嬲follows：1Expression and fe珊entation of a soluble humaDelta-likel proteiiEscher证hi口eo髓To express hDIll in D如盯衍五血，f，wc锄plified the N-tenIlinal sequence ofhDlll丘Dm a h岫an cDNA libmry by PCR and constmcted the GSThDlll gene， which was su

11、ccessfully expressed itl上裔c盯f如地cD疗The e行色cts of cultllre media，carbon source，culture temperature，pH，and dissoIVed oxygen，on me Fowth of 西幽Pri幽m c以and me expression of GST-hDlll protein were systematically jnVesflgated Firstl ythe M9 medjum was selected矗om severaI kjnds ofbasic culturemeLlld，and was

12、adapled for 1he growth ofbacteria and the exl)ression of GST_hDIllIV西北大学硕士学位论文By measuring bacterial伊owt上1 Wim OD600 and protein expwssion 1lvith SDS-PAGE， me optimum conditions、vere es诅blished as f0Ilowing：temperanlre，30。C；initial pH72；the volume of culture broth in shaking nask，50 mL；印proximate mt

13、ation speed，2 l O rmin；carbon source，glycer01Induction was achieved by addition of IPTG(O6 mmolL)埘1en the OD6000fthe bact嘶a reached O71O，and the indu“on was pennitted for 5 h at 30。C when the OD600 of bacteria and expression ofGST_hDlll were 336 and 429，reSpectivel弘Based on me resuIts of shaking fla

14、sk cultiVation，we compared血e batch culne with fcd由ateh culture，and found that the fed-bateh culfl】re was much bener a出lpted to tj】e伊owtll of bacteria卸d the expression ofGST11Dlll tllan t11e batch cultIlre2RecoVery ad renaturation with simultaneous purification of solubIehuman Delta-likel iclusion bo

15、dies by LCThe harvested bacterial paste was resuspended in bu旋r，and lysed by sollication，followed by centrimgationAner washmme inclusion bodies were dissoIVed，refoIded and puri行ed sinluItaneousIy using protein f0Iding Iiquid chromato黟aphy(AFC，SEC，HPHIC and IEC)(1)The purified GST-hDlll was more than

16、 97pure wi也a mass recovery of 89using AFC；(2)The puri丘edGST-hDlll was 95pure using urea掣adiem SEC，with mass recovery of 62The elutcd GSThDll l protein using urca gradicm showed a single peak出er RP-HPLC aIld me p嘶fied product had a pur毋of morc than 99；(3)The cllromatographicalconditions shouldbe opti

17、mized缸ther to get betcer p删fication resuIts using HPHIc a11d IEC for refolding and simultaneous pification ofGSl_-hDlll；(4)The resulting aim proteiIl had a molecular weight of 39 kD when tlle result was con丘rmed withSDSPAGE and MALDITOF，Compared wim GSTthe purified GST-hDlll had anactiVity oftrigger

18、ing Notch receptors，as assessed using a reponer assayKeywords：Notch receptors，GST-hDlll，上0c矗Pr耙矗缸co玩Inclusion body(IB)，Protein folding liquid chromato掣aphy(PFLC)，Refblding a11d purmcationV西北大学钡L学位论文缩略语表英文缩写 英文全名 中译名GST Gglutatllione stransferases 谷胱甘肽硫转移酶 hDIll H帆aIl DeI协Iikel如sion protein 人Delta-li

19、kel融合蛋白 CML Chrollic myeloblastic leukelllia 慢性粒细胞白血病HSC Hemat叩oietic stem cell 造血干细胞HSCT Hematopoietic stem celI tmsplaIlt造血干细胞移植ationAllo。HSCT 越logeneic hematopoietic stem cell异基因造血干细胞移植transpIalltationIB Inclusion body 包涵体PFLC Protein folding liquid c11romatoF印hy 蛋白折叠液相色谱HPHIC Hi曲 perfornlance hy

20、drophobic高效疏水相互作用色谱mteraction chromatogr印hyRPLC Reversed_phase 1iquid chromto反相液相色谱一伊印hyIEC Ionexch锄ge chromatography 离子交换色谱SEC Size-excluSion chromatogr印hy 体积排阻色谱AFC A衔nity c11romato伊aphy 亲和色谱LB Luriabertani medillm LB培养基Amo Ampicillin 氨苄青霉素IPTG Isopropyl-p-Dt11iogalactoside 异丙基一pD一硫代半乳糖苷SDSPAGE So

21、dium dodecyl sulphate polyacryla十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺mine gel electrophoresis 凝胶电泳BSA Boville serum albmin 牛血清白蛋白OD OpticaI densi哆 光密度西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全丫解两北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校有权保留并向国家自-关部门或机构送变论文的复印件和l【l予版。 本人允许论文被食阅和借阅。本人授权两北人学可以将奉学化论文的 令部或部分内容编入订关数据库进行检索，町以采J1J影印、缩印或扫 描饰复制手段保存和iI：编术学位论文。同时授权巾幽科学技术信息研

22、究所等机构将本学位论文收录到中陶学位沦文令文数据雌或jj；它 榴天教据麾。学位论文作者签名。五垂藿一指导教师签名： 壁茎竺：!128年i月辛日 28年蜃月严日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知。除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：丕蠲臣28年月乍日西北大学硕上学位论文文献综述 l慢性粒细胞白血病与造血干细胞

23、移植 11慢性粒细胞白血病的生成与治疗慢性粒细胞白血病(Chronic myeloblastic leukem氓CML)是一组起源于多潜 能造血干细胞异常的恶性骨髓增殖性疾病。费城染色体(Philadelphia c11romosome Ph)是CML的特征性细胞遗传学异常，90以上的cML患者可出现Ph+染色体， 约有5的cML可出现变异的Ph染色体或复杂的染色体核型变化，尤其是在加速 和急变期【1”。CML是由于染色体易位导致BcR-ABL融合基因的形成与表达。因此，CML 的治疗主要是消除Ph染色体，取得细胞遗传学缓解，达到延长生存期的目的。 治疗CML的药物主要有马利兰、羟基脲、干扰素

24、及酪氨酸激酶抑制剂等。马利兰和羟基脲只能用于cML慢性期临床症状的控制，因为这些药物很难诱导CML获得细胞遗传学缓解，也不能阻止cML发展为加速期和急变期吼干扰素虽然能够使50以上的慢性期CML进入遗传学缓解，却很少能诱导 CML达到分子学完全缓解，而CML患者体内残留自血病细胞的存在仍然是复发 的主要原因【4】。 ，甲璜酸伊马替尼(商品名：格列卫)是针对Ph染色体阳性白血病致病基因 产物BcRABL融合蛋白的分子靶向药物51，是一种选择性的酪氨酸激酶抑制 剂，临床效果显著，目前己被公认为CML各期的一线治疗药物61 71。但是，随着 科学家对cML发病机理的研究，发现cML的患者体内存在着可

25、以引起cML的白 血病干细胞。该细胞有正常干细胞自我复制和分化成白血病细胞的能力，生长 与生存并不完全依赖于BcRABL蛋白酪氨酸激酶活性 01，因而利用格列卫并 不能诱导其死亡。更重要的是，患者须长年乃至终身服药，大大增加了患者的 经济负担。西北大学颁卜学位论文12干细胞与造血干细胞移植 干细胞是指尚未分化的细胞，是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化能力的多潜能细胞群体11”j主要存在于早期胚胎、骨髓、脐带、胎盘和部分成 年人细胞中，它分化后能够产生某一组织的一种或多种特定的细胞群体，可以 被培育成肌肉、骨骼和神经等人体组织和器官。因此，干细胞的概念已经被扩 大到可以在体外进行传代并且具有

26、分化潜能的胚胎干细胞。其中，造血干细胞(hematopoietic stem cell，Hsc)是造血前体细胞|：12J，属于干细胞中的一种，通过不 对称性有丝分裂，不断产生大量造血祖细胞，祖细胞进一步增殖和分化，补充 和维持人体外周血细胞1引。成年人血液造血干细胞主要存在于骨髓中，约占骨 髓细胞的O，05，主要功能是通过不断分化产生各系造血祖细胞，成为造血系统 新细胞的来源。同时它们又能自我更新即自我复制，维持自身数量不变，从而 能长期维持机体的正常造血机能【l”。造血干细胞移植(HSCT)已经成为临床治疗 血液病的主要手段。HSCT是指对患者进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体

27、或 自体的Hsc经血管输注给患者，使之重建正常的造血和免疫功能f”。其类型可 分为异体HscT、自体HscT、骨髓移植(BMT)、外周血干细胞移植(PBSCT)以 及脐血移植等几种。很多研究证明，CML是一种对免疫治疗最敏感的疾病，异基因造血干细胞 移植(A1loSCT)可以消除CML患者体内的残留病变。但是，HSCT的核心技术主 要是供者来源，即为患者寻找人体白细胞抗原(HLA)配型完全一致的供者。 AJlo，SCT的供者主要是有血缘关系的相关供者和无血缘关系的无关供者。根据 国际骨髓库和国内文献的资料，A110scT供者以同胞间的相关供者为主，非血 缘的供者不到50。在我国很长的一段时间内

28、，非血缘无关供者的移植将成为 移植的主要类型，父母与子女之间的半匹配移植也成为一种发展方向。对不同造血干细胞来源的A1loScT患者进行比较发现，非血缘和同胞间配 型相合的供者的A110SCT患者的复发率明显低于自体移植、同基因双胞胎移植 及去T细胞移植的患者。最直接的证据是AllosCT后复发的cML患者，输入供者 淋巴细胞可使70一90患者再次获得完全缓解，且分子学复发患者的疗效明显西北大学硕士学位论文优于遗传学和血液学的患者。 虽然脐血移植对于CML患者是一个很好的选择，但出于脐血量少，还远不能提供足够的造血干细胞来满足众多患者移植及移植后的细胞治疗需要。而且， 对于成人患者造血恢复后，

29、重组建的免疫系统抗白细胞作用弱，因此供者干细 胞的来源仍然是限制AlloSCT广范应用的主要原因。造血干细胞的体外大量扩增可以解决HscT治疗中所面临的供者来源不足 问题。而大量研究表明，Notch信号途径是调控干细胞增殖分化的最重要的途 径之一。因此，造血干细胞移植相关产品人Notch配体及其相关蛋白的制备，可更加深入的研究造血干细胞的体外增殖和tch信号途径，也是进行造血干细胞新方法研究的前提。2 Notch信号途径和细胞增殖分化21 Notch受体配体蛋白Delta1ike 1的发现近年来，尤其在新发现了tch在癌症和血管新生方面的功能之后，Notch 信号通道作为一种治疗的目标己经引起

30、许多研究者的关注。许多实验证据表明， Notch信号途径在造血系统发生的多个阶段和多个环节发挥重要作用，如维持 造血干祖细胞的自我更新，决定淋巴细胞的分化，调节髓系细胞分化以及调节 外周T细胞的功能等m 1。Notch信号途径是一条在进化中高度保守，主要调控细胞增殖分化方向的信 号途径，广泛存在于多种生物体内。在胚胎时期以及出生后生长时期，Notch 信号通道在细胞的增殖、凋亡等方面都起着重要作用【19】。在胚胎形成时期，目 标破坏Notchl或它下游结合信号蛋白J(RBPJ)的转录因子，将导致体节组织的 破环，延迟神经管的终止和破坏早期胚胎201。在成年的老鼠中，有条件反射的 基因破环Not

31、chl或RBPJ蛋白，导致淋巴细胞、内皮细胞(EC)和许多其他类 型干细胞产生不F常紊乱，这暗示了这条通道对成人起着至关重要的作用口“。一 更重要的是，最近的研究表明Notch信号的故障0ifl造成允天十牛的疾病例如 伴有皮下梗塞的大脑常染色体nq品性动脉病、自质肺J墒卡AIIa西IIes综合症：I犬等22嗣时皿参j到人类的恶性肿瘤r=Jl 2”。例如，阻塞Notcll信号增J玎了内皮细恺西北大学颤七学位论吏的增粮和肿瘤脉管的密度，同时也抑制了肿瘤生长，这主要是出于心脉管的作 用较弱【241。这一进展已经激发研究者将Notch信号作为癌症治疗的一个新目标。22 Delta1ikel的作用机韦|j由于Notch信号具有促进造血干细胞自我更新，抑制分化的功能，所以激 活Notch信号有利于干细胞的扩增。目前，在哺乳动物中已经发现有5种Notch 配体，分别为Jagged i、Jagged 2、Deltalike I、DeIta-like 3和DeltaIike 4a Notch配体与其受体都是跨膜蛋白125，261，胞外区含有数个表皮生长因子(EGF)样重复序列及保守的D