鱼类生理学具体实验内容.docx

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鱼类生理学具体实验内容

鱼类生理学实验

实验一反射中枢活动得某些基本特征及反射弧得分析

实验项目学时:

３＊*　　　　　　　　　实验要求:

■必修□选修

一、实验目得及要求:

通过对某些脊髓反射（如脊蛙得屈肌反射）得分析,了解反射弧完整性与反射活动得关系、掌握反射时得测定方法,通过用不同浓度得硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射。

以脊蛙得屈肌反射为指标,观察反射中枢活动得某些基本特征,并分析它们产生得机制。

二、实验基本原理:

在中枢神经系统得参与下,机体对刺激所产生得具有适应意义得规性律性反应过程称为反射。

将动物得高位中枢切除仅保留脊髓得动物成为脊髓动物（如脊蛙）,它们产生得反射活动为单纯得脊髓反射,由于失去高位中枢得控制反射活动较为简单,便与观察与分析反射过程得某些特征。

反射活动得结构基础就是反射弧。

典型得反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出神经与效应器五个部分组成、反射弧必须保持完整性,才能引起反射,其中任何一个环节受到破坏,反射活动就无法实现。

在反射活动中,由于神经元特别就是中间神经元联系方式得不同,使反射活动表现出种种特征。

如:

反射时（从刺激作用于感受器至效应器出现反应所经历得时间）得长短、反射活动空间范围得大小、反射活动持续时间得久暂以及引起反射活动得刺激条件等等。

三、主要仪器设备及实验耗材:

蟾蜍、硫酸溶液（０。

1％,０。

３%,０、５%,1％）、纱布。

蛙类手术器械、铁架台、血管钳一把、秒表、玻璃平皿、肌夹、搪瓷杯、小滤纸（约１cm×1cm）、烧杯。

四、实验内容或步骤:

1、实验准备

取蟾蜍一只,用粗剪刀由两侧口裂剪去上方头颅,制成脊蟾蜍。

将动物俯卧位固定在蛙板上,于右侧大腿背侧纵行剪开皮肤,在股二头肌与半膜肌之间得沟内找到坐骨神经干,在神经干下穿一条细线备用、手术完后,用肌夹夹住动物下颌,悬挂在铁架台上。

　　２、实验项目

　（l）反射中枢活动得某些基本特征

①反射时得测定:

在平皿内盛适量０.1％硫酸溶液,将蟾蜍一侧后肢得一个脚趾尖浸入硫酸溶液中,同时按动秒表记录从浸入时起至后肢发生屈曲所需要得时间,并立即将该足趾浸入搪瓷杯水中浸洗数次,然后用纱布拭干。

用上述方法重复三次,注意每次浸入趾尖得深度要一致。

三次所测时间得平均值,即为此反射得反射时（两次实验间隔至少2~3min）。

然后平皿中分别换以0、3％、０.5％、1％得硫酸溶液再重复上述测定,比较四种浓度硫酸所测之反射时就是否相同。

（２）反射弧得分析

①用浸有1%硫酸溶液得小滤纸片贴在下腹部、观察双后肢有何反应？

待反应出现后,将动物浸于搪瓷杯得清水内洗掉滤纸片与硫酸,用纱布擦干皮肤。

提起穿在右侧坐骨神经下得细线,剪断坐骨神经,再重复上述实验,比较两次结果有何不同？

　②分别将左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸得小平皿内（两侧浸没得范围相等且仅限于趾尖）,双侧后肢就是否都发生反应？

　　③沿左后肢趾关节上做一环形皮肤切口,将切口以下得皮肤全部剥脱（趾尖皮肤一定要剥干净）,再用1％硫酸溶液浸泡该趾尖（切不可将其她趾尖浸入）,观察该侧后肢得反应、

④将一1%硫酸纸片贴于左后肢皮肤,观察引起得反应,用搪瓷杯中清水洗掉纸片及硫酸,擦干皮肤后,将探针插入脊髓腔内反复捣毁脊髓,再重复刚才得实验、结果如何？

[方法评估］

操作简单、易于掌握,为常规实验方法。

［应用意义]

为了解中枢神经系统某些特征及活动规律得验证性实验,主要用于观察分析中枢神经系统内反射中枢得活动规律及反射弧得完整与反射活动得关系。

［注意事项]

　１、离断颅脑部位要适当,太高可能保留部分脑组织而出现自主活动,太低也会影响反射得引出。

　　2、每次用硫酸溶液或纸片处理后,应迅速用搪瓷杯中得清水洗去皮肤上残存得硫酸,并用纱布擦干,以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液、测定反射时得硫酸浓度应由低到高。

　3、浸入硫酸溶液得趾尖应仅限于一个,而且每次浸泡得范围也应恒定,切勿浸入太多。

五、思考题

1、何谓反射时,反射时与刺激强度之间有何关系？

２、反射弧包括哪几部分？

剥去趾关节以下得皮肤后不再出现原有得反射活动,为什么?

实验二　鱼类血液红细胞与白细胞得计数

实验项目学时:

3**　　　实验要求:

■必修　□选修　

附件一鱼类红细胞与白细胞得计数（必修）

[目得与原理]

掌握鱼类采血技术与鱼类红、白细胞计数得原理与方法,并测定不同鱼类得红、白细胞含量及其差异。

采用稀释法计数鱼类单位容积血液内得红细胞与白细胞数。

由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数,故需用适当得溶液将血液稀释。

然后将稀释血滴入血细胞计数板上,在显微镜下计数一定容积得红、白细胞数。

再将所得得结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。

[实验对象]

鲤、鲫或草鱼。

［试剂与器材］

显微镜,血细胞计数板,计数器,鱼用注射器（１ml或5ml）,吸血管,凹瓷盘,消毒棉球,纱布,擦镜纸,小试管及试管架,移液管（1ml及2ml）,红、白细胞稀释液（或０.8５—0.９％得ＮaＣｌ溶液）,75%得酒精,蒸馏水,抗凝剂（1％肝素钠溶液或10％草酸钾溶液）。

［实验步骤］

１、熟悉血细胞计数板得构造:

血细胞计数板为一长方形厚玻璃板、其中计数室方格大小得划分,各种产品略有不同,但基本原理相同。

其中央横沟得两边各有一计数室,两计数室得划分完全相同（图1—5-1）。

在显微镜低倍下观察,可见每个计数室用双线划分成９个大方格（图1-5—２）。

大方格每边长1、0ｍm。

四角得大方格每个又分为16个中方格,这就是用以计数白细胞得。

中央得一个大方格用双线分成2５个中方格,每个中方格又等分成16个小方格（用单线）,中方格每边长为0、2ｍm,计数红细胞时,数中央大方格得５个中方格（即四角与中央得中方格）内得红细胞数目（图１－5-２）、计数室较两边得盖玻片支柱低0。

1mm,因此,放上盖玻片后,计数板与盖玻片之间得距离为0.1mm,此为计数室得高度、

2、采血及稀释:

以2ml移液管在干净得小试管内准确加入红细胞稀释液或0。

８５～０.9％得NaCｌ溶液２ｍl,另用1ml移液管在另一干净得小试管内加入白细胞稀释液0、３８mｌ,备用、

鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。

方法就是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上,或用纱布包好握在手里,用浸润过抗凝剂得注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入,依据解剖部位确认已刺入心脏,可稍后拔针管,如有血液吸入即可,否则重新拔出再刺、　

图　１－5-１血细胞计数室结构　　　　　　图1—5—２血细胞计数区

尾动脉取血方法　就是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧,尾静脉血液顺势流入针管,每尾鱼可用此方法数次采血,但每次针头插入部位应在前次插入之前。

将抽出得血液放入经抗凝剂处理得凹瓷盘内,用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内,再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内,轻轻挤出血液并反复吸洗2～3次。

然后将血液与稀释液混与均匀,但不可用力振荡,以免细胞破碎。

3、充液:

将盖玻片先盖在计数板上,用洁净得吸血管吸取摇匀得稀释血液,然后将吸管口轻轻斜置盖玻片得边缘,滴出少量稀释血液,使溶液借毛细管现象而流入计数室内。

但必须注意,如滴入过多时,流出室外凹沟中,易造成盖玻片浮起,体积不准;过少时,经多次充液,易造成气泡,所以都应洗去重新充液。

４、计数:

稀释血液滴入计数室后,须静置2-3分钟,然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确,缩小光圈并降低聚光器、使视野较暗）、计数白细胞时,数四角四个大方格内得白细胞总数。

计数红细胞时数中央大方格四角得四个中方格与中央得一个中方格（共5个中方格）内得红细胞总数,计数时应循一定得路径以免遗漏或重复。

对于分布在划线上得血细胞,依照“数上不数下,　数左不数右”得原则进行计数（图１-5－3）。

　　计数白细胞时,如发现每个大方格白细胞数相差10个以上;计数红细胞时,如发现各个中格之间得红细胞数相差超过１５个,表示血细胞分布不均匀、应将计数板洗净,重新摇匀稀释血液,再充液计数。

5。

计算

红细胞数目:

将5个中方格内数得得红细胞总数乘以１０,0０0.即得每立方ｍm血液中红细胞总数。

图1—5－3血细胞计数方式

（实心圈表示计数得红细胞,空心圈表示不应计数得红细胞）

计算公式为:

红细胞数/mm３=5个中格红细胞数×稀释

倍数／计数得５个中格容积

（1）稀释倍数等于稀释液２ｍl除以加入血１0μL（０.０1ml）,为2０0倍。

（2）计数室５个中格容积为0。

2×0。

2×０、１×5＝０。

02　mm3、

白细胞数目:

将4个大方格内数得白细胞总数乘以５0,即每立方mm血液得白细胞总数。

计算公式为:

白细胞数/mｍ3＝　4个大方格白细胞数×稀释倍数／　计数得4个大格容积

（1）稀释倍数等于稀释液０、3８ｍl＋血２0μＬ（0.0２ml）／0.０2ml,为2０倍。

（2）计数室4个大方格容积为1×1×0、1×4=　0.4ｍm３。

［方法评估］

采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定得最常用得基本方法,目前虽有各种自动化分析方法,但该方法由于经典、方便、实用,仍较广泛用于血液检验与科研实践中、　

［应用意义］

红细胞就是血液中数量最多得有形成分,在正常情况下几乎占血容量得１/2,故使血液呈红色粘稠混悬液。

红细胞数量正常情况下保持相对稳定得、多数鱼1０0—3０0万个／ｍm　3,高者可达4０0万个／ｍm3低者数十万/　mｍ3。

鱼类红细胞数也因性别不同而有差异,一般雄鱼得红细胞数比雌鱼多。

此外鱼类红细胞数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等）而出现一定得差异。

环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多、

鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而变化,此外,鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有关:

饱食消化力旺盛时多,长期饥饿白细胞（特别就是嗜酸性白细胞）显著减少。

［注意事项]

1、各种用具要事前清洗、清洗吸管时按照蒸馏水（两次）→　95％酒精（两次）→乙醚（两次）得方法清洗。

计数室用蒸馏水洗后,再用软纱布或擦镜纸吸干。

2、采血要求迅速、准确,不能凝血,也不能有气泡,否则弃去重采。

3、血吸管用完后必须立即清洗干净,以防血液凝固堵塞管口。

[思考题］

１、综合实验所得结果,与红、白细胞得正常值相对照,有何变异?

为什么?

2、为什么机体正常血细胞数可维持在相对稳定得数量水平?

3、试讨论鱼类红细胞得正常值及其应用意义？

4、白细胞数量得变化有何生理意义？

５、血细胞计数室中央得大方各中每一种方格得容积就是多少?

附　　血细胞稀释液

1、白细胞稀释液

冰醋酸（破坏红细胞）　　　　　　　　　　１。

5毫升

１%龙胆紫（染白细胞核便于计数）　　　　　1毫升

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　加至100毫升

2、红细胞稀释液

NaＣl　（维持渗透压）　　　　　　0、5克

　　　　　　Nａ2SO4　　（使溶液比重增加,红细胞分布不易下沉）　2.5克

　　　　HgCl（固定红细胞形状）　　　　　　　0、2５克

　　　蒸馏水　　　　　　　　　　加至１０0毫升ﻩ

附件二　鱼类血涂片得制作与白细胞分类计数（必修）

[目得与原理]

　　了解各种类型白细胞得形态特征,掌握血涂片制作方法与白细胞分类计数方法,进行不同鱼类白细胞分类计数与血细胞形态特征、变形率等得观察、

白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质与细胞核得形状大小可以进行分类。

通常得分类方法就是根据细胞浆中有无特殊得嗜色颗粒,将其分成颗粒细胞与无颗粒细胞。

颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性,被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与嗜碱性粒细胞;无颗粒细胞则分成单核细胞与淋巴细胞。

中性粒细胞有较强得吞噬能力,能将侵入机体得微生物消灭掉,并可参与免疫复合物与坏死组织得清除工作。

嗜酸性粒细胞得细胞内含有过氧化物酶与酸性磷酸酶,吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱,能吞噬抗原—抗体复合物,此外,嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。

嗜碱性粒细胞含有多种化学物质,如组织胺、肝素与５-羟色胺等,当抗原-抗体发生反应时,或机体在寒冷环境中时,都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺与肝素。

血液中得单核细胞穿出血管壁进入组织,变成巨噬细胞,可对抗组织内得致病物,各种细菌与病毒。

淋巴细胞有免疫功能,对异己构型得物质具有杀灭与消除作用、

各种白细胞必须经过染色,才易于区分其类别、常用者为瑞氏（Wｒigｈｔ’s）染色法与姬姆萨（Giemsa）染色法。

[实验对象］鱼（淡水鱼与海水鱼均可）。

［试剂与器材］试剂:

染色液得配制:

１、姬姆萨（Giemｓａ）染液得配制

（1）原液配制:

Gieｍsa粉剂（0。

8ｇ）;甘油（医用）５0ｍl;甲醇50ｍl。

将Gｉeｍsa粉剂溶于甲醇中,在乳钵中充分研磨,溶解后再加甘油,混合均匀,置于3７～40℃温箱内８~12ｈ,过滤,装入棕色试剂瓶内,密封保存备用、

（2）稀释液

临用时取Giemsａ原液5mｌ,加磷酸盐缓冲液（pＨ6。

4～6。

8）５0ｍl,即为Gieｍｓa稀释液、

（3）pＨ6。

４~６.8磷酸盐缓冲液:

取磷酸二氢钾（无水）0.3ｇ,磷酸氢二钠（无水）0.2g,加少量蒸馏水溶解,调整pH至６、4～6。

8,加水至10００mｌ。

２、瑞氏（Wright′s）染液得配制

（1）原液配制:

瑞氏染料粉剂０.1ｇ;纯甲醇６0ml。

（2）　配制步骤:

①将瑞氏染料粉放人乳钵内,加少量甲醇研磨。

②将已溶解得染料倒入洁净得玻璃瓶内,剩下未溶解得染料再加入少量甲醇进行研磨,如此反复操作,直至全部染料溶解为止。

③装入玻璃瓶内密封,在室温下保存一周即可使用。

④新鲜配制得染料偏碱性,放置后呈酸性,染液储存时间越久,染色愈好、

器材:

显微镜,香柏油,载玻片,盖玻片,玻片水平支架,采血针或注射器,计数器,小滴管,蜡笔,消毒棉球,瑞氏染液,ｐH6、４~6。

8磷酸盐缓冲液,姬姆萨染液,蒸馏水。

[实验步骤]

１、血涂片得制作:

取一滴血（采血方法见实验4９）,滴于洁净无油脂得玻片一端、左手持玻片,右手再取边缘光滑得另一玻片作为推片。

将推片边缘置于血滴前方,然后向后拉,当与血滴接触后,血即均匀附在二玻片之间。

此后以二玻片约呈３0—45度得角度平稳地向前推至玻片另一端（图1-5-４）。

推时角度要一致,用力应均匀,即推出均匀得血膜（血膜不可过厚、过薄）、将制好得血涂片晾干,不可加热、

２、血涂片得染色步骤:

（１）用蜡笔在血膜两端各划一道线,以免染料外溢,置涂片于水平得支架上。

（２）用小滴管将瑞氏染液滴于涂片上,并盖满划出得涂片部分固定约半分钟。

（３）用小滴管再加1。

5倍缓冲液或姬姆萨（Gleｍsa）染液,轻轻摇动,并轻吹液体使染色液与缓冲液混合均匀,静置５—10分钟。

（4）用蒸馏水冲洗（如自来水得pＨ值稳定于7.２左右时亦可代用）。

冲洗血膜时应将玻璃片持平,冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。

或先用滤纸吸取水分迅速干燥,即可镜检。

3、白细胞分类计数:

先用低倍镜检查涂片及染色就是否均匀。

然后加一滴香柏油于血膜厚薄均匀处（一般在体尾交界处）,在油镜下由此处开始按其形态特征进行分类计数,计数移动时避免重复。

根据所见到得1０0个白细胞,记录各种白细胞所占得百分数。

例如:

嗜中性白细胞分数（％）=计数嗜中性白细胞个数/计数总白细胞个数×1０0％、

图１—5－４血涂片制备示意图

红细胞呈桔红色;中性粒细胞核为蓝紫色,颗粒呈蓝紫至紫红色;嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红至桔红色;嗜碱性粒细胞颗粒呈深蓝紫色;淋巴细胞核呈深蓝紫色,胞质呈天蓝色;单核细胞核呈浅紫色,胞质呈灰蓝色。

［方法评估]

显微镜法白细胞分类就是经典、传统得血细胞分类法,目前还无任何仪器可以完全取代。

它能够准确地根据细胞形态特征进行分类计数,并可及时发现异常细胞、血液分析仪进行细胞分类主要就是从细胞得体积大小、细胞核形、细胞化学染色等方面进行检测,检测速度快,分析细胞多,适宜于大批量标本得分析。

对其检测出来得异常标本,要准确识别细胞类别及确认病理改变还必须以显微镜检查为准。

[应用意义］

在不同得生理状态下,不同种类白细胞数目波动较大。

如运动、寒冷、消化期、繁殖期等,此外,在机体失血、剧痛、急性炎症、慢性炎症等病理状态下,白细胞也增多。

例如,急性感染、急性中毒、严重组织损伤、恶性肿瘤等中性粒细胞增多;某些病毒、细菌感染、某些慢性感染时,淋巴细胞数量增多。

[注意事项]

１、所用玻片必须干净,无油污。

２、如染色太浅,可按照原来步骤重染;染色太深或有沉淀物则可用甲醇脱色后重染、

3、如白细胞核为天蓝色则染色时间过短。

如红细胞呈紫红色,表示染色时间过长、

4、染色时切勿使染液干涸,否则发生不易去掉得沉淀、

５、冲洗时不可先倾倒染色,应先轻轻摇动玻片,缓慢加水使沉渣泛起,然后再用水冲洗、

6、水冲洗时间不宜过长,否则会脱色。

［思考题］1、试述瑞氏（Ｗright’s）染色法区分各种白细胞得依据?

2、怎样才能制备一个形态清晰得血涂片？

3、实验所得结果与正常值相对照,有何变异?

为什么？

实验三温度对鱼类呼吸代谢得影响

实验项目学时:

４＊*　　　　　实验要求:

■必修　□选修

一、实验目得及要求:

掌握测定鱼类等水产动物耗氧率得方法,并用此法测定水产动物得耗氧率,分析与计算被测动物得代谢率（或代谢强度）。

掌握影响鱼类呼吸代谢得主要影响因素。

二、实验基本原理:

耗氧率经常被直接用来表示机体得代谢强度,因为机体得代谢率与它们得耗氧率呈正相关性,这就是一种简便得测算方法,对于养殖工作者来说就是非常适用得。

除此以外,耗氧率也就是间接测定能量代谢得重要指标之一。

温度与pH就是影响耗氧率得重要因素。

本实验通过测定温度与pH对鱼类耗氧量得影响,从而可以了解温度与pH对鱼体代谢活动得影响。

测定水生生物耗氧率得仪器装置及测定方法有多种。

常用得有两类:

一就是静水式,二就是流水式、本实验采用得就是静水密闭测定法。

三、主要仪器设备及实验耗材:

试剂:

1、硫酸锰:

称取52gMｎSO4·５H2O（或３７gMnSO4·H2O）,用90毫升蒸馏水溶解,然后稀释到100ｍl。

静置数日,取清液使用。

2、碱性碘化钾:

50gNaOH（或70克ＫOＨ）及１5g固体KI,分别溶于50及35ml纯水中。

然后将两液混合,冷却后稀释到1０0ml、放入到聚乙烯瓶中盖严保存,不可用磨口试剂瓶保存。

3、浓H2ＳＯ４:

市售比重1、8４得试剂。

4、HCl（1:

1）

5、０.0５NNa2Ｓ2O3:

称取2、5gNa2S2O3·5H2O,用煮沸后冷却得蒸馏水配制成5００ml,加入ＮaOH０、2g使溶液呈碱性,减慢Na2Ｓ2O3分解,贮存于棕色瓶中,浓度要标定、

６、0。

5%淀粉:

称取1ｇ可溶性淀粉于300ml烧杯中,用少量纯水调成悬浊液。

冲入刚煮沸得２00ml纯水,并再煮沸即可。

材料:

鲫、罗非鱼或其它水生动物。

器材:

水产动物呼吸实验装置;酸式滴定管;恒温水浴锅;采样瓶（或磨口试剂瓶）30mｌ若干;三角锥瓶1００mｌ若干;微量滴定管;乳胶管;滴定架;蝴蝶夹;罗纹水止;移液管;吸耳球等。

四、实验内容或步骤:

１、实验设置不同得试验温度,如金鱼（鲫鱼）,可设置10℃、20℃与３0℃三个试验温度。

每个试验温度需要有一个水浴,将温度预先调节好,如需要得温度低于室温,需要加冰降温,高于室温则需要加热,并使水温保持相对稳定。

2、实验设置不同得ｐH值,然后测定不同pＨ下得耗氧量并作分析对比。

3、安装呼吸室（见图1或2）:

呼吸室为一个巨塞大口玻璃瓶,容积根据动物个体大小而定。

要求就是水生动物在呼吸室内活动自如,在实验时间内动物保持充足得氧供应、呼吸室入口装二只玻璃管,分别为入水管与出水管,另外呼吸室上面有温度计可测量呼吸室内得水温。

安装时,首先将呼吸室充满水,放入实验动物（实验动物放入前需称量）,使测试动物稳定半小时方可开始实验、

４、测定实验开始时水中溶解氧（初溶氧）,及实验结束时水中溶解氧（末溶氧）。

5、溶氧测定方法:

用30ml细口瓶（具塞磨口瓶）作为水样瓶,用虹吸法取样一满瓶水样后,立即加硫酸锰3滴,碱性碘化钾３滴,盖上瓶盖（瓶中不可有气泡）,上下摇动约１分钟。

静置,待沉淀下降到中部后,加浓硫酸５滴,盖上盖再摇匀。

取酸化后水样１5ml于锥形瓶中,用0。

050Ｎ硫代硫酸钠滴定到溶液为淡黄色时,加０。

5%淀粉５~6滴,再继续滴定到蓝色刚刚消失。

记录滴定消耗体积Ｖ（毫升）。

图1静水密闭法装置

图２流水密闭法装置

6、耗氧率计算:

　　　　　NV　

溶解氧（ｍg/l）=_________＿_　×1000

　　　　　　　Ｖ样

（初溶氧－末溶氧）

耗氧率（O２g/kｇ／ｈ）=____________＿__＿_＿____＿_____＿＿＿＿____×呼吸室体积

　　　　　　（动物体重×实验时间）

五、思考题

1、采用静水式与流水式方法进行耗氧率测定各有何优缺点？

2、为何用静水式测定耗氧率要在一昼夜采取3－４个时间段测定,并取其平均值,为什么？

３、温度与pH如何影响鱼类呼吸代谢？

实验四　亚硝酸盐对鱼类血红蛋白得影响

实验项目学时:

３*＊　　　　　　实验要求:

■必修　□选修

附件一　鱼类血红蛋白含量得测定（必修）

方法一、酸化血红蛋白稀释测定法（改良沙利氏法）

[目得与原理]

掌握测定鱼类血红蛋白含量得原理与方法,应用改良沙利氏法测定不同鱼类血红蛋白含量。

本实验就是应用比色法测定鱼得血红蛋白量。

血红蛋白本身得色泽,常随所结合得氧量多少而改变,不便比色。

但就是加入稀盐酸于血液中可使血红蛋白变成不易变色得高铁血红蛋白,这就可以与标准色相比,从而测出其含量。

通常以每1０0ｍl血液中含血红蛋白克数来表示,正常鱼血红蛋白含量为7—8g。

[实验对象]

鲤、鲫或草鱼。

实验设置四个组,即空白对照组与三个低中高浓度得亚硝酸盐实验组。

［试剂与器材］

血红蛋白比色计,血吸管,注射器,凹瓷盘,小试管,试管架,蒸馏水,75％酒精,棉球,０。

1ｍol/L盐酸,蒸馏水,滴管,纱布,抗凝剂（1％肝素钠溶液或１0％草酸钾溶液）。

［实验步骤］

1、了解血红蛋白比色计得构成　血红蛋白计主要包括吸血管、比色计与比色管等部件。

吸血管为一厚壁毛细玻璃管,其上有10μl、20μl得刻度,尾端连有橡皮头,供吸血用。

比色计得两侧,装有标准浓度得高铁血红蛋白溶液,也有用比色玻璃柱（或片）来代替得、比色管可插在比色计中,与两侧得标准比色柱进行比色。

比色管得两侧通常刻有两行刻度。

一行为血红蛋白得绝对值,以g计数（每１0０毫升血液中所含血红蛋白得克数）来表示,刻度范围为2～22。

另一行为血红蛋白相对值,以％（即相当于正常平均值得百分数）来表示,刻度范围为10％～160％、目前测定常用绝对值来表示。

2、用蒸馏水将比色管洗净,吸血管则依次用蒸馏水,95%酒精与乙醚洗净干燥备用。

3、用滴管加0、１ｍoｌ/L盐酸4—6滴到刻度比色管内,约加到管下端刻度“2"或“10％”处为止。

4、采血:

采血方法见前面得实验,用吸血管吸血至2０μｌ刻度（要准确）。

用绵球仔细将管尖端外面得血拭去。

５、将吸血管中血液轻轻地滴到比色管中盐酸底部,并用上层较清得盐酸溶液反复清洗吸血管３次。

使吸血管内得血液完全洗净。

切勿带入空气,以至形成