HPLC知识.docx

HPLC知识.docx

《HPLC知识.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPLC知识.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

HPLC知识

液相色谱仪器常见参数之二：

泵和进样器

①泵的结构和原理是什么？

（hmzhou83）:

输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。

对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。

因此，恒流泵的应用更广泛。

输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。

机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。

（wangboxzzjs）:

HPLC使用的高压泵应满足下列条件：

a流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1～10ml/min）；

b能抗溶剂腐蚀；

c有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150～300×105Pa。

（1）往复式柱塞泵

当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。

反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。

这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

（2）气动放大泵

其工作原理是：

压力为p1的低压气体推动大面积（SA）活塞A，则在小面积（SB）活塞B输出压力增大至p2的液体。

压力增大的倍数取决于A和B两活塞的面积比，如果A与B的面积之比为50：

1，则压力为5×105Pa的气体就可得到压力为250×105Pa的输出液体。

这是一种恒压泵。

（03yx2）:

高效液相色谱仪中的高压恒流泵必须能可靠的运转.但是要做到长时间低维护的可靠运转,就需要对泵有足够的了解,并注意与之有关的事项.目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复式柱塞泵.凸轮与连杆将电机的圆周运动转变为柱塞杆的线性运动,在有单向阀的结构中,柱塞杆将常压下储液瓶中的流动相吸至泵腔后再送出,其耐压可达41MPa.通过改变凸轮的形状和电机的转速及柱塞杆的尺寸可以将流动相的脉动降至最小.如果对泵的各个部分都有清楚的认识,将来排出操作过程中出现的故障就很简单了.

泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆.单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成.在压力的作用下宝石球离开阀座,流动相流过单向阀;反之,在反向力的作用下,宝石球回到阀座上,此时流动相不再流过单向阀.显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏.为了保证单向阀不发生泄漏,一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座,也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上.在不同的应用领域,单向阀阀体的材料有所不同,例如考虑生物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛,而不用不锈钢.为了降低成本和减少维护费用,一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件,当然其功能仍保持不变.

②怎么才能辨别泵的好坏？

（wangboxzzjs）:

1.流量稳定性：

可通过实验测定，稳定性越好，流量越准，说明泵越好；

2.脉冲大小：

检查泵在工作时产生的脉冲，脉冲越小泵越好；

3.密封性：

检查泵各处的密封性，密封性越好泵越好；

4.耐用性：

这需要很长时间的一段运行才能看出，时间长而泵的性能变化越小，说明泵越好。

具体可参照以下方式进行：

一．流量：

1．测试内容：

（1）准确度：

以5次测定平均值与标称值的绝对误差表示

（2）精密度：

以5次测定的相对标准偏差表示

2．测试方法：

连接一定的负载，在泵压>0.5MPa的恒压状态下，待流速稳定后，用称量瓶在流动相出口处接取一定的流动相，然后用天平称重，按温度校正后的流动相密度计算流动相体积，根据接取流动相的时间，计算流量。

流动相：

高纯水

测试装置：

秒表；万分之一的分析天平；精度为±0.1℃的温度计

流量.................接取流动相的时间.................测定次数

0.01ml/min...........10min...........................5次

1.00ml/min...........1min........................5次

5.0ml/min............1min........................5次

二．压力：

1．耐压性（密封性）

以高纯水为流动相，堵死泵出口，压力保护设定为36MPa，泵停后记录泵压，10min后再次记录泵压，以泵压降低大小表示泵密封性好坏。

2．压力脉动（压力波动）

以高纯水为流动相，接色谱柱，调节流速，控制泵压恒定在10MPa，待泵压稳定后，每分钟记录一次泵压值，共记录10次，以最大值和最小值之差表示压力脉动。

三．梯度：

1．准确度：

以甲醇／水为流动相，在甲醇:

水（体积比）为：

10:

90、50:

50和

90:

10时接取流动相，用空毛细管柱，GC-FID测定甲醇含量。

2．重复性：

按照国家液相色谱仪计量检定规程（JJG705-2002）进行。

3.线性：

当流动相：

A为高纯水，B为含0.1%丙酮的水时，设定线性梯度：

T＝0时A＝100％，B＝0％；T＝15min时，A＝0％，B＝100％（在流动相为A＝100％，B＝0％基线稳定后开始梯度）。

用紫外检测器在210nm检测（保证响应信号不超过检测器的线性响应范围），记录流动相变化时紫外吸收曲线。

测试两次。

四．耐用性

测试方法：

在接色谱柱的条件下，调节流速，控制泵压恒定在15MPa；流动相：

水：

甲醇（70：

30），连续运行21天，流动相循环使用，每天用滤纸测试泵体可能有的泄漏，记录测试结果。

21天后停泵，做一次耐压测试（按照二.1进行）

注释：

1．在测0.01ml/min流量时，接取流动相的时间较长，如水的挥发影响较大，可采用微量注射器直接接到流动相出口，用微量注射器直接测定体积。

2．在测试梯度准确度时，如发现用空毛细管柱，GC-FID测定甲醇含量的误差较大，不能满足梯度准确度时，可采用光度法与之比较。

3．厂家的泵在设计上如有特殊之处，在测试时需要采取一些特殊方法时，厂家可提出，与测试组协商解决。

（

③泵的材质是什么？

（tlyb69）:

现在的泵一般是蠕动泵，材质各不相同，泵的最大耐压当然是越大越好.

（wangboxzzjs）:

阀体大多采用不锈钢，也有用金属钛的；阀座一般采用塑料或陶瓷；柱塞杆往往采用蓝宝石，其他材质如陶瓷，氧化锆等也有用。

④泵的最大耐压是多少？

根据什么来计算的？

psi是什么单位？

压力越大越好吗？

（tlyb69）:

PSI英文全称为Poundspersquareinch。

P是磅pound,S是平方square,I是英寸inch,psi是压强的单位,即【磅力/平方英寸】1psi=6.89475729kPa

（wangboxzzjs）:

耐压性以高纯水为流动相，堵死泵出口，压力保护设定为36MPa，泵停后记录泵压，10min后再次记录泵压，以泵压降低大小表示泵密封性好坏。

⑤“泵系统滞后体积<Ｘ　ul且不受系统反压影响”有什么作用？

滞后体积的大小对检测有什么意义？

越大越好吗？

（tlyb69）:

泵系统滞后体积<Ｘ　ul且不受系统反压影响可以保证泵的取样体积的准确性，滞后体积的大小对检测有一定的影响，越小越好.

⑥流量范围是根据什么来的？

越大越好？

对分析物质有何影响？

（fde234）：

流量范围是根据步电机的功率来计算。

一般根据自己所需要来选择流量的范围。

（03yx2）：

除了功率还和柱塞杆横切面大小，冲程速度有关。

⑦流量准度和精度一般各是多少？

流量准度和精度越大越好吗？

一般是什么范围？

（wangboxzzjs）:

（1）准确度：

以5次测定平均值与标称值的绝对误差表示

（2）精密度：

以5次测定的相对标准偏差表示

测试方法：

连接一定的负载，在泵压>0.5MPa的恒压状态下，待流速稳定后，用称量瓶在流动相出口处接取一定的流动相，然后用天平称重，按温度校正后的流动相密度计算流动相体积，根据接取流动相的时间，计算流量。

流动相：

高纯水

测试装置：

秒表；万分之一的分析天平；精度为±0.1℃的温度计

流量.................接取流动相的时间.................测定次数

0.01ml/min...........10min...........................5次

1.00ml/min...........1min........................5次

5.0ml/min............1min........................5次

（fde234）：

流量准度和精度数值越小越好，一般范围：

流量精度：

<0.1%RSD，流量准度<±0.1%

⑧比例准度和比例精度是怎么计算的？

数值是越大越好还是越小越好？

有何意义？

①自动进样器的结构是什么？

（0205100221）:

我用过的是waters-uplc主要组成部分：

自动清洗系统，进样内外针及送样系统，定量环及六通阀，样品区定位装置等等；

（melu）:

自动进样器用六通进样阀作为进样阀,它包括圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）两部分.定子连接到管路,样品环,进样孔以及其他外围部件,一般是用不锈钢或者陶瓷等耐磨材料制造.转子和定子紧密结合,操作时可以转动,一般用较定子柔软的材料制成,如碳氟聚合物.自动进样器的转子是通过电动马达带动的（有一些较老的型号使用压缩空气带动）,而手动进样器则是在转子上连了一个手柄.转子包括一些细小的刻槽用于连接到不同的定子位置.,定子和相关的连接在表示阀体的圆圈以外,而转子的U形的连接通道被画在圆圈以内.转子处于load或fill位置,这时样品正在充入样品环,同时泵直接将流动相送入色谱柱;转子转至inject位置,连接泵的通路和样品环连接,流动相将其中的样品冲入色谱柱.

主要包括:

A.吸入式自动进样器（Pull-to-FillAutosampler）

这种自动进样器中样品是被注射器产生的吸力吸入样品环,早期这种设计因其简单可靠而非常流行,后来随着另两种设计的出现而走向没落.图3a是其示意,此例中注射器连在废液排出口,采样针和相应的管路连在进样口,针插入样品瓶中,接着注射器回吸直到样品完全充满样品环,转子旋转将样品进样.这种设计非常简单,只有针沿一个轴运动（上/下）,通过旋转样品盘将所需样品瓶置于针下.有一种简化设计更加简单--将一个密封的瓶盖压入瓶里以使样品进入样品环,取消了另一端的注射器.如果简单是吸入式自动进样器的优点,那么浪费样品就是其缺点.像图3a所示,样品在进入样品环之前,首先必须充满采样针和相连的管路,就造成10-100ul的样品被浪费,这种情况的影响取决于总的样品量.由于简单的设计,多数此类自动进样器都使用可旋转的样品盘按固定序列进样,同时需要在样品瓶之间放置一个清洗瓶或加装分离的清洗装置.

B.推入式自动进样器（Push-to-FillAutosampler）

推入式设计的自动进样器更为常见,这种技术和手动进样极为相似.注射器移至样品瓶,吸入预定量的样品,再移至进样口,将样品注入样品环,.这种设计需要的样品量远小于吸入式设计.注射器的吸取和排出都是在步进马达控制下完成的,可以达到很高的精密度和准确度,正常情况下完全装液法和部分装液法的结果偏差都小于0.5%.推入式自动进样器通常都在吸入式设计的基础上增加了一些功能,比如任意样品序列,更多的清洗功能,程控进样等.样品盘布局有圆形的,还有一种可以在样品瓶支架或96孔样品板上做三维运动的进样臂.这种自动进样器通常配有不同容量的样品环,最常见的是100-500ul.某些老式的自动进样器配备了5ml甚至是10ml的不可更换式样品环.

C.整体样品环自动进样器（Integral-LoopAutosampler）

近几年整体样品环自动进样器变得流行起来,这种设计的优点在于没有样品的浪费,尤其适于样品量有限的痕量分析.整体样品环自动进样器的运转过程比较复杂,自动进样器处于清洗状态,根据设计的不同清洗液被吸入,排出样品环或二者均有,这时针被固定在高压密封圈内;图4b表示针移至样品瓶内,样品被吸入样品环;最后针又插入高压密封圈内,转子转至进样位置（图4c）.由于样品只存在于清洗过的样品环内,所以全部样品都被进样,不会造成浪费.最大进样体积则取决于样品环容量,但这种样品环很难更换.典型的整体样品环自动进样器的最大进样体积是100ul.

整体样品环式设计

a:

针和样品环清洗

b:

样品环充液

c:

进样

②自动进样器与手动进样器谁的检测误差大？

（0205100221）:

看情况了。

完全进样情况下，误差差不多；部分进样时，差别较大，此时操作人员造成误差。

③自动进样器和手动进样器的优点和缺点分别是什么？

（0205100221）:

自动进样器主要缺点：

价格昂贵，一旦损害，修复价格也昂贵！

上次样品区定位小车坏了，针也弯了，就花费20000元维修！

手动进样主要缺点：

工作人员不能腾出时间进行其它实验！

（hmzhou83）:

进样器是个六通阀.手动进样器就是个比较简单的装置，直接用手扳,自动的比较复杂，需要自动手臂，手臂位置定位，计量泵（用于吸取量的多少），驱动装置（用于驱动六通阀），真正进样装置：

六通阀。

（duliuhui）:

自动进样的优点：

定量误差小，重复性好，设定程序后自动运行可节省大量人力资源（尤其对于大批量样品检测）。

自动进样缺点：

价格昂贵，结构复杂，维护要求高，维修成本高。

手动进样的人为因素较多，定量误差和重复性要差一些（部分进样法）；价格相对便宜，易于维护和修理。