饲料添加剂I粪肠球菌质量内控标准提供伟嘉版本.docx
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饲料添加剂I粪肠球菌质量内控标准提供伟嘉版本
DBNF-SW-5-Y005
北京大北农科技集团股份有限公司内控标准
饲料添加剂（Ⅰ）粪肠球菌质量内控标准
2013-6-16发布2013-7-1实施
北京大北农科技集团股份有限公司发布
前言
本标准由北京大北农科技集团股份有限公司提出并起草。
本标准主要起草人：
刘雪连
本标准于2013年7月首次发布
饲料添加剂（Ⅰ）粪肠球菌质量内控标准
1范围
本标准规定了粪肠球菌产品的要求、检验方法、检验规则、标签、包装、运输和贮存。
本标准适用于本公司生产的粪肠球菌饲料添加剂。
2规范性引用文件
下列文件对本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T4789.3-2003
食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
GB/T14699.1-2005
饲料采样
GB/T5917.1-2008
饲料粉碎粒度测定法
GB/T6435-2006
饲料中水分的测定
GB10648
饲料标签
GB/T13079-2006
饲料中总砷的测定
GB/T13080-2004
饲料中铅的测定原子吸收光谱法
GB/T13091-2002
饲料中沙门氏菌的检验方法
GB/T14699.1-2005
饲料采样方法
GB/T18823-2002
饲料检测结果判定的允许误差
JJF1070-2005
定量包装商品净含量计量检验规则
国家质量监督检验检疫总局第75号令（2005）定量包装商品计量监督管理办法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1杂菌数
指在选择培养基上，除粪肠球菌外的其他细菌和霉菌菌落数之和。
3.2杂菌率
指杂菌数在目的菌种数和杂菌数之和中所占百分率。
4要求
4.1感官指标
表1粪肠球菌的感官要求
产品名称
项目指标
色泽
气味
杂质
外观
DBN粪肠球菌原粉
淡黄色至黄褐色粉状
具有乳酸特有的酸甜味，无腐败，无异臭味
无异物
粉末状
DBN粪肠球菌可溶原粉
淡黄色至黄褐色粉状
具有乳酸特有的酸甜味，无腐败，无异臭味
溶解度大于95%，无异物
粉末状
DBN粪肠球菌菌粒
乳白色至淡黄色颗粒状
具有乳酸特有的酸甜味，无腐败，无异臭味
无异物
颗粒状或条状
4.2理化指标
理化指标应符合表2的规定。
表2粪肠球菌理化指标
产品名称
项目指标
孔径
水分
≤
粪肠球菌活菌数
（×108个/g）≥
DBN粪肠球菌原粉
7%
500
DBN粪肠球菌可溶原粉
7%
500
DBN粪肠球菌菌粒
0.8mm
10%
500
4.3卫生指标
标准名称卫生指标应符合表3的要求。
表3粪肠球菌卫生指标
项目
指标
杂菌率≤
0.1%
致病菌（肠道致病菌或致病性球菌）
不得检出
总砷（以As计）（mg/kg）
≤2.0
铅（以Pb计）（mg/kg）
≤5.0
其它卫生指标
符合NY/T14442007中4.1.3的规定
4.4净含量
按国家质量监督检验检疫总局第75号令执行。
5检验方法
本标准使用的水，在未注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级用水的要求。
本标准所使用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯（AR）。
如有特殊要求另作明确规定。
5.1抽样
按GB/T14699.1-2005的规定，进行样品的采集。
采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀。
在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。
样品采集后应立即进行检验。
5.2感观检验
取一定量（固态250g、液态250ml）的样品于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。
5.3水分测定
按GB/T6435-2006规定方法测定。
5.4成品粒度测定
按GB/T5917.1-2008规定方法测定。
5.5粪肠球菌检测
按附录A（规范性附录）执行。
5.6卫生检测
5.6.1砷含量测定
按GB/T13079-2006规定执行。
5.6.2铅含量测定
按GB/T13080-2004规定执行。
5.6.3霉菌检测
按GB/T13092规定执行。
5.6.4细菌总数
按GB/T13093规定执行。
5.6.5致病菌检测
按GB/T13091-2001、GB/T4789.5-2008和GB/T4789.10-2003规定执行。
5.6.7杂菌率
计算公式：
5.7净含量
按JJF1070-2005规定执行。
5.8监测与仲裁判定
检测结果判定的允许误差按GB/T18823-2002规定执行。
6检验规则
6.1检验分类
产品的检验分为出厂检验和型式检验两类。
6.2组批与取样
6.2.1组批：
同品种、同一生产线、同一天内生产的同一批料为一批。
6.2.2取样：
按GB/T14699-2005方法取样，每批产品包装袋数为1-4时，每袋取样；每批产品包装袋数为5-16袋时，最少取4袋；每批产品包装袋数大于16袋时，最少取
袋。
每批取样量不少于0.5kg。
6.3出厂检验
感官指标、水分、粒度、微生物含量（含活菌数和杂菌率）指标为出厂检验项目，产品出厂前必须由公司质检部门检验合格并出具合格证，方可出厂。
6.4型式检验
6.4.1一般情况下，企业半年进行一次型式检验。
但有下列情况之一时，亦须进行型式检验。
a）产品成批出厂前；
b）原料、配方、生产工艺及设备有重大变化时；
c）产品停产3个月以上需要重新恢复生产时；
d）国家质量监督机构要求进行质量抽查时。
6.4.2型式检验项目：
第4章所规定的全部项目。
6.5判定规则
6.5.1在保证产品质量的前提下，生产厂可根据工艺、配方、设备、原料等变化情况，自行确定出厂检验的批量。
6.5.2检验时如产品已霉烂变质、有明显结块或有致病菌检出，卫生指标不合格，则判定该批产品为不合格产品，不得复检；
6.5.3活菌指标若低于表2规定值的80%者为不合格项，允许在原样本中加倍取样复检，以复检结果为依据。
若仍有不合格项，则判定该批产品为不合格产品。
7标签、包装、运输、贮存、保质期
7.1标签
采用鲜明的标签贴于外包装，标签内容应符合GB10648的规定要求。
7.2包装
包装为铝箔袋、纸箱包装或纸塑复合袋包装。
包装应符合运输和贮存的要求。
7.3贮运
贮运过程中防雨、防潮、防止日光暴晒。
不得与有毒有害或其它污染物品混装、混运。
7.4贮存
产品应贮存在凉爽、通风、干燥的库房内，或阴凉贮存。
不得与有毒有害或其它污染物品混贮。
7.5保质期
在符合贮存运输的条件下，自生产日期起保质期为12-15个月。
附录A
（规范性附录）
粪肠球菌检测方法
A1范围
生产分析和质量控制部门适用。
A2原理
细菌呈球状、球杆状，0.5-0.8μm,常成对或短链状排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。
在血平板上菌落呈针尖大小、灰白色、圆形、表面光滑凸起、溶血。
在葡萄糖肉汤中呈均匀混浊生长。
革兰氏阳性，过氧化氢酶呈阴性，能在6.5%氯化钠肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤及45℃生长，能分解葡萄糖产酸不产气，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖，硝酸盐还原阴性，精氨酸双水解阳性，最适生长温度36℃，最适pH4.7-7.6。
A3试验方法
A3.1仪器设备和材料
A3.1.1生物显微镜（10×100）
A3.1.2菌落计数器
A3.1.3恒温培养箱（36±1℃）
A3.1.4恒温干燥箱
A3.1.5恒温摇床
A3.1.6灭菌锅
A3.1.7无菌室或超净工作台
A3.1.8酸度计
A3.1.9架盘药物天平：
0-500g，精度至0.5g
A3.1.10试管：
Ф15mm×150mmФ18mm×180mm
A3.1.11灭菌培养皿：
直径9cm
A3.1.12三角瓶：
500ml
A3.1.13无菌吸管：
1ml（具有0.01ml刻度）5ml，10ml（具有0.1ml刻度）
A3.1.14玻璃刮刀或L型玻璃棒（涂布棒）
A3.1.15灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和剪刀
A3.1.16酒精灯
A3.1.17载玻片
A3.1.18镊子
A3.1.19接种环、接种针
A3.1.20均质器或微型振荡箱
A3.2培养基和试剂
A3.2.1除特别注明外，试验中所有试剂为分析纯试剂，水为蒸馏水或相应程度的水，溶液为水溶液。
A3.2.2BPY琼脂培养基（配置方法见附录B1）
A3.2.3血琼脂培养基（配置方法见附录B2）
A3.2.4pH9.6的肉汤培养基（配置方法见附录B3）
A3.2.5耐盐试验培养基（配置方法见附录B4）
A3.2.640%胆汁肉汤培养基（配置方法见附录B5）
A3.2.7糖类发酵培养基（配置方法见附录B6）
A3.2.8硝酸盐培养基（配置方法见附录B7）
A3.2.9索恩利氏培养基（配置方法见附录B8）
A3.2.10革兰氏染色液（配置方法见附录B9）
A3.2.11解囊液（配置方法见附录B10）
A3.2.12乳酸纸层析法（配置方法见附录B11）
A3.2.13格里斯氏试剂（配置方法见附录B12）
A3.2.14二苯胺试剂（配置方法见附录B13）
A4粪肠球菌菌落数检测
A4.1检验程序如下
检样
↓
用无菌水做成几个适当倍数稀释液
↓
选择2-3个适当稀释度各0.1ml，加入富集培养基平皿
↓
36±1℃培养24小时
↓
菌种鉴别检验
↓
菌落计数
↓
报告
A4.2操作步骤
A4.2.1采样
A4.2.1.1采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
A4.2.1.2以无菌操作称取经过充分摇匀的待检样10克移入含有90毫升解囊液（按本标准附录B10规定执行）的灭菌三角瓶内，并于振荡器中恒温振荡培养器中36℃,200rpm预处理30分钟，做成1:
10的均匀稀释液，混合均匀。
A4.2.1.3用无菌吸管吸取1:
10稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中，并于微型振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3分钟，充分摇匀制成1:
100的稀释液。
A4.2.1.4用无菌吸管吸取4.2.1.3的稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中，进行10倍梯度稀释，并于微型振荡器上混合3min。
每个稀释度换用一支1.0ml灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-8。
A4.2.2平板计数法
A4.2.2.1估计样品的含菌量，选择三个连续稀释度，分别在作10倍稀释的同时，各取0.1ml分别加到计数培养基平皿，均匀涂布，各个稀释度作3个平皿，最好同时作2种培养基，同时作无菌水空白对照。
以上操作全过程需在20min内完成。
A4.2.2.2将平板倒置于36℃恒温中培养，培养24小时后观察菌落特征。
A4.2.2.3选取具有30-300个典型菌落的平板，进行计数。
并计算同一稀释度三个平板的平均菌落数。
A4.2.2.4根据证实试验确定为粪肠球菌的菌落数，按比例计算出该皿内的粪肠球菌的菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克（或ml）样品所含粪肠球菌数并作出报告。
例：
将检样10-6稀释液0.1ml涂布于选择富集培养基平板上，生成的可疑菌落数为35个，取5个进行鉴定，证实为菌粪肠球菌菌的是4个，则1g样品中菌粪肠球菌菌数为（35×4/5）×106×10=1.2×108。
A4.2.2.5计数后，将可疑菌落、目标菌落分别接种于营养琼脂斜面，与37℃培养24小时，进行粪肠球菌鉴定试验。
A5粪肠球菌的鉴定
A5.1在pH9.6的肉汤培养基上的生长试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种葡萄糖肉汤（pH9.6）液体培养基，并将未接种的空白作对照，于36℃培养18—24小时，观察生长情况，培养基有混浊物为阳性。
粪肠球菌能够在pH9.6的肉汤培养基上的生长。
A5.2耐盐试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种耐盐培养基，并将未接种的空白作对照，于35℃培养3-7天，与未接种的对照管对比，观察培养液的混浊情况，记录试验结果。
粪肠球菌能够在6.5%NaCl的培养基上生长。
A5.3耐胆盐试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种40%胆汁肉汤（pH9.6）液体培养基，置35℃培养24-48小时，观察有无细菌生长。
阳性菌呈颗粒状生长，上液澄清，管底有沉淀；阴性菌则不生长。
粪肠球菌为阳性，可以生长。
A5.4葡萄糖产酸和产气试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种乳酸菌葡萄糖发酵培养基，并将未接种的空白作对照，于36℃培养2-3天，观察记录。
若产酸则培养基变黄色，并可用pH计测定pH值，用纸层析法检查是否为乳酸。
若产气则德培拉姆氏小试管中有气泡。
粪肠球菌发酵葡萄糖产乳酸不产气，pH可达4.1-4.6，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。
A5.5硝酸盐还原试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，种硝酸盐培养基，并将未接种的空白作对照，于35℃培养3天，在干净的比色瓷盘小窝中倒入少许已接种培养的培养液，再滴一滴格里斯氏试剂的A液及B液。
在对照中同样加入格里斯氏试剂的A液及B液各一滴。
观察并记录溶液是否变色，若变红色则为阳性，若无红色出现，再加入一滴二苯胺试剂，如溶液变为蓝色则为阴性，不变蓝色，则为阳性。
粪肠球菌为硝酸盐还原阴性。
A5.6精氨酸双水解酶测定试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，穿刺接种索恩利氏培养基，并用灭菌的凡士林油封管，并将未接种的空白作对照，于35℃培养3、7、14日观察，培养基转为红色者为阳性，不变者为阴性。
粪肠球菌的精氨酸双水解酶测定试验呈阳性。
A5.7结果解释及报告
符合粪肠球菌群的特征，有较强的耐盐性、耐胆碱性、能在pH9.5的培养基上很好的生长、葡萄糖发酵产酸不产气、发酵山梨醇、不发酵阿拉伯糖、硝酸盐还原阴性、精氨酸双水解酶测定试验呈阳性，则可报告为粪肠球菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他试验。
附录B
（规范性附录）
专用培养基和试剂
B1BPY琼脂培养基
葡萄糖5g
酵母膏5g
氯化钠5g
大豆蛋白胨10g
牛肉膏5g
碳酸钙0.7g
蒸馏水1000mL
按以上配方配制培养基，溶解后用40%的氢氧化钠溶液调pH为6.8-7.0，高温蒸汽灭菌锅121℃，20min灭菌。
B2血琼脂培养基
蛋白胨10g
葡萄糖2g
氯化钠5g
磷酸二氢钾2.5g
柠檬酸钠5g
脑浸汁800ml
猪心浸汁200ml
羊血10%
pH7.2
注：
猪心和猪脑浸汁法：
（1）新鲜猪心除去心头和脂肪，搅碎100克加蒸馏水至1000ml；
（2）新鲜猪脑除去血管，取200g加蒸馏水至1000ml；
（3）50℃保温1小时，然后煮开15min;
（4）冷却后用纱布过滤备用。
B3pH9.6的肉汤培养基
pH9.6的肉汤100ml
葡萄糖2g/L
注：
将普通肉汤调整pH9.6，加入葡萄糖溶解后，分装试管，每管2～3ml，121℃灭菌15min,备用。
B4耐盐培养基
蛋白胨10g
牛肉膏3g
氯化钠65g
蒸馏水1000ml
将上述成分溶解后，调节pH7.0，分装试管，高压灭菌121℃15min～20min，冷至45℃，备用。
B540%胆汁肉汤培养基
蛋白胨10g
氯化钠5g
牛肉浸膏5g
新鲜胆汁（猪、牛）400ml
蒸馏水600ml
先将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠加热溶于蒸馏水中，调pH至7.6，加入胆汁混匀后，分装试管，每管3ml，置115℃灭菌20min，冷藏备用。
取新鲜猪（牛）胆若干只，取胆汁用纱布过滤，装于瓶中115℃灭菌20min,冷却后置4℃冰箱内，次日取出吸取上清液备用。
B6糖类发酵培养基
B6.1基础培养基
蛋白胨1%
酵母膏0.5%
吐温800.1%（v/v）
盐溶液A0.5%（v/v）
盐溶液B0.5%（v/v）
溴甲酚紫（1.6%水溶液）约1.4ml
盐溶液A：
KH2PO410g
K2HPO410g
蒸馏水100ml
盐溶液B:
MgSO4·7H2O11.5g
MnSO4·2H2O2.4g
FeSO4·7H2O0.68g
蒸馏水100ml
B6.2以上成分溶解后调pH到6.8-7.2，分装试管。
121℃高压灭菌20-30min。
B6.3葡萄糖、阿拉伯糖、山梨醇各10g
B6.4将山梨醇和阿拉伯糖配制成10%的水溶液，经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。
B7硝酸盐培养基
牛肉蛋白胨培养基1000ml
KNO31g
培养基配制好后，调节pH7.0-7.6，分装试管，每管4-5ml，121℃蒸汽灭菌15-20min,冷至45℃，备用。
B8索恩利氏培养基
蛋白胨1g
NaCl5g
K2HPO40.3g
洋菜6g
酚红0.01g
L-精氨酸盐10g
蒸馏水1000ml
将以上成分加热溶解，调节pH7.0-7.2，分装试管，每管4-5ml，121℃蒸汽灭菌15-20min,冷至45℃，备用。
B9革兰氏染色法
B9.1结晶紫染色液
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
B9.2革兰氏碘液
碘1.0g
碘化钾2.0g
蒸馏水300.0ml
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振荡，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml.
B9.3沙黄复染液
沙黄0.25g
95%乙醇10.0ml
蒸馏水90.0ml
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
B9.4染色
B9.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
B9.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min水洗。
B9.4.3滴加95%乙醇脱色约15-30s,或将乙醇滴满整个涂片，立即倒去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10min.
B9.4.4水洗，滴加复染液，复染1min,水洗、待干、镜检。
B9.4.5结果
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
B10解囊液
柠檬酸9.6g，磷酸氢二钠14.2g加蒸馏水至1000ml,调节pH至7.5，分装，121℃,15min灭菌，备用。
B11乳酸纸层析法
B11.1展开剂：
水、乙醇、正丁醇以1：
5：
5的量相混合，然后加1%的甲酸。
B11.2显色剂：
0.04%的溴酚蓝酒精溶液，用0.1%的NaOH调pH到6.7。
B11.31mol/L乳酸标准溶液：
吸取分析纯乳酸8.4ml，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，备用。
B11.40.1mol/L乳酸标准使用液：
将1mol/L乳酸标准溶液稀释至0.01mol/L。
B11.5点样
选择大小合适的国产新华滤纸，在滤纸下方距边约3cm处划条横线，每隔2.5-3cm划一点作为点样位置，并表明点样编号。
用干净的毛细管沾取样品点样，每点一次样品用吹风机吹干，0.01mol/L乳酸标准使用液为对照。
B11.6层析
将点好样的滤纸放入层析缸，先用展开剂饱和一夜，然后加展开剂开始层析。
上行25cm左右取出晾干，喷显色剂，并与对照比较黄色斑点的位置，确定是否是乳酸。
B12格里斯氏试剂
A液：
将对氨基苯磺酸0.8g，溶解于2.5mol/L乙酸溶液100ml；
B液：
将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100ml中。
B13二苯胺试剂
将二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。
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