分子杂交技术.docx

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分子杂交技术

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分子杂交技术

　　互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。

杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

　　杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。

该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。

根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交,即细胞原位杂交。

探针必须经过标记，以便示踪和检测。

使用最普遍的探针标记物是同位素,但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

　　核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。

因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。

第一节核酸探针标记的方法

　　核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。

下面将介绍各种类型的探针及标记方法。

　　一、双链DNA探针及其标记方法

分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。

双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:

切口平移法和随机引物合成法。

　　1.切口平移法（nicktranslation）当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。

同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。

由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。

最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。

切口平移反应受几种因素的影响:

（a）产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。

（b）DNA酶Ⅰ的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。

（c）DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。

　　材料：

待标记的DNA。

　　设备：

高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

（1）10×切口平移缓冲液:

0.5mol/LTris·Cl（pH7.2）;0.1mol/LMgSO4;10mmol/LDTT;100μg/mlBSA。

（2）未标记的dNTP原液:

除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/LTris·Cl（pH7.5）溶液中,浓度为0.3mmol/L。

　　（3）[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP:

400Ci/mmol,10μCi/μl。

　　（4）E.coliDNA聚合酶Ⅰ（4单位/μl）:

溶于50μg/mlBSA,1mmol/LDTT,50%甘油，50mmol/LTris·Cl（pH7.5）中。

　　（5）DNA酶Ⅰ:

1mg/ml。

　　（6）EDTA:

200mmol/L（pH8.0）。

　　（7）10mol/LNH4Ac。

　　操作步骤:

（1）按下列配比混合:

　　　　未标记的dNTP10μl

　　　　10×切口平移缓冲液5μl

　　　　待标记的DNA1μg

　　　　[α-32P]dCTP或dATP（70μCi）7μl

　　　　E.coliDNA聚合酶4单位

　　　　DAN酶I1μl

　　　　加水至终体积50μl

（2）置于15℃水浴60分钟。

　　（3）加入5μlEDTA终止反应。

　　（4）反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

　　[注意]1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32P]-dNTP。

　　　　　2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

　　2.随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。

合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。

通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。

利用随机引物进行反应的优点是：

（1）Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。

（2）反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。

（3）反应产物的比活性较高,可达4×109cpm/μg探针。

（4）随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

　　材料：

待标记的DNA片段。

　　设备：

高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

（1）随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。

（2）10×随机标记缓冲液：

900mmol/LHEPES（pH6.6）;10mmol/LMgCl2。

　　（3）Klenow片段。

　　（4）20mmol/LDTT。

　　（5）未标记的dNTP溶液：

dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。

　　（6）[α-32P]dATP：

比活性>3000Ci/mmol,10μCi/μl。

　　（7）缓冲液A：

50mmol/LTris·Cl（pH7.5）;50mmol/LNaCl;5mmol/LEDTA（pH8.0）;0.5%SDS。

　　操作步骤:

（1）200ng双链DNA（1μl）和7.5ng随机引物（1μl）混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。

（2）与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5mleppendorf管内混合下列化合物:

　　　　20mmol/LDTT1μl

　　　　未标记的dNTP溶液1μl

　　　　10×随机标记缓冲液1μl

　　　　[α-32P]dATP（比活性>3000Ci/mmol;10μCi/μl）3μl

　　　　ddH2O1μl

　　（3）将步骤

（1）eppendorf管中的溶液移到步骤

（2）管中。

　　（4）加入5单位（约1μl）Klenow片段,充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒,使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。

　　（5）在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。

同时计算放射比活性。

　　[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。

　　　　　2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

　　二、单链DNA探针

　　用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。

而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。

采用单链探针则可解决这一问题。

单链DNA探针的合成方法主要有下列两种

1）以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;

（2）以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针。

　　1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。

在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳（如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）将探针与模板分离开。

双链RF型M13DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。

材料：

已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。

　　设备：

高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

（1）10×Klenow缓冲液：

0.5mol/LNaCl,0.1mol/LTris·Cl（pH7.5）;0.1mol/LMgCl2。

（2）0.1mol/LDTT溶液。

　　（3）[α-32P]dATP：

3000Ci/mmol,10μCi/μl。

　　（4）40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。

　　（5）dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。

　　（6）Klenow片段（5单位/ml）。

　　（7）适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。

　　（8）0.5mol/LEDTA（pH8.0）。

　　操作步骤：

（1）在0.5mleppendorf管中混合如下溶液：

　　　　单链模板（约0.5pmol）1mg

　　　　适当引物5pmol

　　　　10×Klenow缓冲液3ml

　　　　加水至20ml

（2）将eppendorf管加热到85℃5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；

　　（3）依次加入：

　　　　DTT2ml

　　　　[a-32P]dATP5ml

　　　　未标记的dATP1ml

　　　　dGTP,dCTP,dTTP混合液1ml

　　混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。

　　（4）加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。

　　（5）加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。

　　（6）68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。

调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。

　　（7）加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ,HindⅢ等）酶切1小时。

　　（8）酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/LEDTA（pH8.0）至终浓度10mmol/L。

　　（9）用电泳方法分离放射性标记的探针。

　　2.从RNA合成单链cDNA探针cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。

用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:

（1）用寡聚dT为引物合成cDNA探针。

本方法只能用于带Poly（A）的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA3'末端序列。

（2）

可用随机引物合成cDNA探针。

该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。

但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多,应预先尽量富集mRNA中的目的序列。

　　反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经SephadexG-50柱层析即可得到单链探针。

材料：

已提纯的RNA或mRNA

　　设备：

高速台式离心机，恒温水浴锅等。

　　试剂：

（1）合适的引物：

随机引物或oligo（dT）15-18。

（2）5mmol/LdGTP,dATPdCTP,dTTP。

　　（3）[a-32P]dCTP（>3000Ci/mmol,10mCi/ml）。

　　（4）反转录酶（200000单位/ml）。

　　（5）100mmol/LDTT。

　　（6）250mmol/LMgCl2。

　　（7）1mol/LKCl。

　　（8）0.5mol/LEDTA（pH8.0）。

　　（9）10%SDS。

　　（10）RNasin（40单位/ml）。

　　操作步骤:

（1）在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：

　　　　RNA或mRNA10.0ml

　　　　合适的产物（1mg/ml）10.0ml

　　　　1mol/LTris·Cl（pH7.6）2.5ml

　　　　1mol/LKCl3.5ml

　　　　250mmol/LMgCl22.0ml

　　　　5mmol/LdNTP10.0ml

　　　　[a-32P]dCTP10.0ml

　　　　0.1mol/LDTT2.0ml

　　　　Rnasin20U

　　　　加水至48ml

　　　　反转录酶（200000单位/ml）2ml

　　混匀后,稍稍离心，37℃保温2小时。

（2）反应完毕后加入下列试剂：

0.5mol/LEDTA（pH8.0）2ml10%SDS2ml

　　（3）加入3ml3mol/LNaOH。

68℃保温30分钟以水解RNA。

　　（4）冷却至室温后,加入10ml1mol/LTris·Cl（pH7.4）。

混匀。

然后加入3ml2mol/LHCl。

　　（5）酚/氯仿抽提后，用SephadexG-50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的探针。

[注意]RNA极易降解，因而实验中的所有试剂和器皿均应在DEPC处理后，灭菌备用。

　　三、末端标记DNA探针

　　现以Klenow片段标记3'末端为例说明末端标记的方法。

　　1、材料：

待标记的双链含凹缺3'末端的DNA。

　　2、设备：

高速台式离心机，水浴锅等。

　　3、试剂：

（1）3种不含标记的dNTP各为200mmol/L。

（2）合适的限制酶。

　　（3）[α-32P]dNTP:

3000Ci/mmol,10mCi/ul。

　　（4）Klenow片段（5U/ml）。

　　（5）10×末端标记缓冲液:

0.5mol/LTris·Cl（pH7.2）,0.1mol/LMgSO4,1mmol/LDTT,500mg/mlBSA。

　　4、操作步骤：

（1）25μl反应体系中用合适的限制酶酶切1μg的DNA。

（2）按下列成分加入试剂并混匀：

已酶切的DNA1mg（25ml）10×末端标记缓冲液5ml2mmol/L3种dNTP1ml[a-32P]-dNTP适量加水至50ml

　　（3）加入1单位的Klenow片段,室温下反应30分钟。

　　（4）加入1ml2mmol/L第四种核苷酸溶液,室温保温15分钟。

　　（5）70℃加热5分钟,终止反应。

　　（6）用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀来分离标记的DNA,或用SephdadexG-50柱层析分离标记的DNA。

　　[注意]

　　1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段。

　　2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。

　　3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。

　　四、寡核苷酸探针

　　利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。

常用的寡核苷酸探针主要有两种:

单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。

单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。

　　1、材料：

待标记的寡核苷酸（10pmol/μl）。

　　2、设备：

高速离式离心机，恒温水浴锅等。

　　3、试剂：

（1）10×T4多核苷酸激酶缓冲液:

0.5mol/LTris·Cl（pH7.6）,0.1mol/LMgCl2,50mmol/LDTT,1mmol/LSpermidine·HCl,1mmol/LEDTA（pH8.0）。

（2）[γ-32P]ATP（比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml）。

　　（3）T4多核苷酸激酶（10单位/ml）。

　　4、操作步骤：

（1）100ng寡核苷酸溶于30ml水中。

置65℃变性5分钟，迅速置冰溶中。

（2）立即加入下列试剂：

　　　　10×激酶缓冲液5ml

　　　　[g-32P]ATP（比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml）10ml

　　　　T4多核苷酸激酶2ml

　　　　加水至50ml

　　混匀后置37℃水浴20分钟。

　　（3）再加入20单位T4多核苷酸激酶，置37℃水浴20分钟后立即置冰浴中。

　　（4）SephadexG-50柱层析。

　　此方法是在每个探针的5'末端多加了一个磷酸，理论上，这会影响其与DNA的杂交。

因此，建议使用KlenowDNA聚合酶的链延伸法获得高放射性的寡核苷酸探针。

　　除了常见的同位素标记探针外，还有利用非同位素标记探针和杂交的方法，许多公司都有不同的非同位素标记探针的杂交系统出售，可根据这些公司所提供的操作步骤进行探针的标记和杂交。

　　五、RNA探针

　　许多载体如pBluescript,

pGEM等均带有来自噬菌体SP6或E.coli噬菌体T7或T3的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA的RNA聚合酶所识别,合成特异性的RNA。

在反应体系中若加入经标记的NTP，则可合成RNA探针。

RNA探针一般都是单链,它具有单链DNA探针的优点,又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：

RNA

NA杂交体比DNA

NA杂交体有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。

RNA:

RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:

RNA杂交体容易控制,所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。

　　噬菌体依赖DNA的RNA聚合酶所需的rNTP浓度比Klenow片段所需的dNTP浓度低,因而能在较低浓度放射性底物的存在下,合成高比活性的全长探针。

用来合成RNA的模板能转录许多次,所以RNA的产量比单链DNA高。

并且用来合成RNA的模板能转录多次，可获得比单链DNA更高产量的RNA。

　　反应完毕后，用无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理,即可除去模板DNA,而单链DNA探针则需通过凝胶电泳纯化才能与模板DNA分离。

　　另外噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶不识别克隆DNA序列中的细菌、质粒或真核生物的启动子，对模板的要求也不高,故在异常位点起始RNA合成的比率很低。

因此,当将线性质粒和相应的依赖DNA的RNA聚合酶及四种rNTP一起保温时,所有RNA的合成,都由这些噬菌体启动子起始。

而在单链DNA探针合成中,若模板中混杂其他DNA片段,则会产生干扰。

但它也存在着不可避免的缺点，因为合成的探针是RNA，它对RNase特别敏感，应而所用的器皿试剂等均应仔细地去除RNase；另外如果载体没有很好地酶切则等量的超螺旋DNA会合成极长的RNA，它有可能带上质粒的序列而降低特异性。

第二节几种常见的杂交

　　分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：

（1）Southern杂交

NA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。

被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。

（2）Northern杂交:

RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。

被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。

　　根据杂交所用的方法,另外还有斑点（dot）杂交、狭槽（slot）杂交和菌落原位杂交等。

有3种固相支持体可用于杂交:

硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman541滤纸。

不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在DNA固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。

Whatman541滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。

该滤纸主要用于筛选一些基因文库。

固定化DNA的杂交条件基本与使用硝酸纤维素滤膜时所建立的条件相同。

Whatman541滤纸与硝酸纤维素滤膜相比有一些优点:

它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。

然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用硝酸纤维素滤膜时所得到的信号强度。

因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用硝酸纤维素滤膜作为固相支持体。

分子杂交技术

（一）

一、概述

　　前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。

杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。

分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。

由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。

使单链聚合双链的过程称为退火或复性。

用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。

　　核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。

该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。

Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。

变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。

典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。

该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。

60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。

该法是研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：

从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。

剪切的DNA液（含0.12mol/L磷酸盐缓冲液或0.18mol/lNa+），经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。

然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。

通常该实验可比较不同来源生物DNA的复性速率，并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。

　　60年代中期Nygaard等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。

如Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。

RNA在代谢过程中被3H尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA杂交，继而用RNase处理，消化非特异性结合的RNA。

漂洗后计数以测定杂交探针的量。

通过计算与已知量DNA杂交的RNA量即可评估rRNA基因数。

由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。

　　进入70年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。

例如，对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。

固相化的PolyU–Sepharose和寡（dT）-纤维素使人们能从总RNA中分离Poly