诊疗方案中国结核病病理学诊断专家共识.docx

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诊疗方案中国结核病病理学诊断专家共识

【诊疗方案】中国结核病病理学诊断专家共识

结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一，世界卫生组织最新统计数据显示，2015年全球有超过1000万新发结核病患者，死亡人数达180万[1]。

病理学诊断是微生物学之外最重要的结核病确诊途径，在痰菌阴性的肺结核及肺外结核的诊断中发挥着非常重要的作用。

近年来，随着分子病理学技术的快速发展，结核病的病理学检查可为临床提供更明确的诊断，如结核病与非结核分枝杆菌病的鉴别诊断及耐药结核病的诊断等。

为了促进我国结核病病理学诊断水平的提高，增进临床医生对结核病病理诊断的认识，中华医学会结核病学分会组织病理学及临床领域专家共同探讨了结核病病理学诊断的相关问题，并最终形成'结核病病理学诊断专家共识'。

一、结核病的分类及其病理变化

（一）结核病的分类结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC）引起的传染性疾病[2]，可发生在全身多种脏器，其中以肺部最为常见。

结核病按照发病部位可分为肺结核与肺外结核。

肺结核指发生在肺实质的结核病。

肺外结核指发生在肺脏以外器官的结核病，常见发病部位有胸膜、淋巴结、骨与关节、脑膜与脑、皮肤、肠道及泌尿生殖系统等[3]。

（二）结核病的病理变化结核病的病理变化主要包括渗出性病变、增生性病变和坏死性病变。

在结核病的发展过程中，受结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）毒力、感染菌量及机体自身免疫力不同等因素的影响，上述3种病理变化常混杂存在，在不同阶段，多以某种病理改变为主并相互转化[4]。

1．渗出性病变：

渗出性病变主要出现在结核性炎症的早期或机体免疫力低下、MTB量多、毒力强或变态反应较强时，表现为浆液性或浆液纤维素性炎。

病理改变主要为局部组织小血管扩张、充血，浆液、中性粒细胞及淋巴细胞向血管外渗出，渗出液中主要为浆液和纤维蛋白，之后出现中性粒细胞减少，代之以淋巴细胞和巨噬细胞为主要细胞成分，巨噬细胞可吞噬MTB。

在渗出性病变中可查到MTB。

当机体抵抗力强或治疗及时，渗出性病变可完全吸收而不留痕迹，但亦可转化为增生性病变或坏死性病变。

2．增生性病变：

当感染的MTB量少、毒力低或免疫反应较强时，出现以增生反应为主的病变。

增生性病变是结核病病理特征性的病变，主要表现为肉芽肿形成，包括坏死性和非坏死性肉芽肿，有时形成结核结节。

肉芽肿病变的主要成分为类上皮细胞（亦称上皮样细胞）及多核巨细胞。

肉芽肿病变并非结核病所特有，亦可出现在其他病变中，如真菌病和结节病等。

结核性肉芽肿病变中可见类上皮细胞、朗格汉斯巨细胞及干酪样坏死等。

结核结节是结核性肉芽肿病变中较特异的形态结构，结节中心常为干酪样坏死，坏死周边围绕类上皮细胞及散在的朗格汉斯巨细胞，结节的外侧为淋巴细胞及少量反应性增生的纤维母细胞。

单个结节一般较小，肉眼不易区别，当3～5个结核结节融合在一起时则为粟粒大小，呈灰白色或灰黄色。

类上皮细胞是增生性病变的主要成分，是由巨噬细胞在MTB菌体脂质的作用下转化而成。

朗格汉斯巨细胞是由类上皮细胞相互融合而成[5]，体积较大，大小不一，直径为100～500μm，细胞核为数个至上百个不等，呈花环状或马蹄形排列在细胞质一侧，这与其他多核巨细胞的形态有所不同。

3．坏死性病变：

当MTB量多、毒力强、机体抵抗力低下或变态反应强烈时，渗出性和增生性病变可出现以坏死为主的病理变化。

结核性坏死属凝固性坏死的一种，因坏死组织中含有MTB脂质和巨噬细胞在变性坏死过程中产生的细胞内脂质等，这种坏死组织不液化，呈淡黄色，均匀细腻，呈细颗粒状，形态似奶酪，故称干酪样坏死。

干酪样坏死中含有数量不等的MTB，可长期以休眠的形式生存。

干酪样坏死灶可出现钙化或骨化，周围纤维组织增生，继而形成纤维包裹，病变可长期稳定。

在某些因素作用下，干酪样坏死灶亦可出现液化，液化的物质可成为MTB的培养基，使其大量繁殖，导致病变渗出、扩大。

当病灶与外界相通（如位于肺脏、肾脏等）时，液化坏死物质可经肺支气管及肾输尿管排出，形成空洞性结核，并成为结核病的重要传染源。

二、病理学诊断结核病的主要方法

（一）常规病理学诊断常规病理标本的诊断包括大体检查和显微镜下检查。

1．大体检查：

标本的大体观察非常重要，应详细记述标本大小、形状、表面和切面颜色、质地、病变部位、大小、形状、有无干酪样坏死和钙化，有无空洞、空洞大小和数量、洞壁厚度、内壁是否光滑等。

典型的大体标本呈灰黄色，质地细腻且形似奶酪的坏死组织（干酪样坏死），对结核病的诊断具有提示作用。

随着微创技术在临床的广泛应用，目前病理标本大多为内镜活检、穿刺活检和细针吸取的小标本，缺少手术切除标本的大体观察，病理科医生在诊断中要谨慎，防止漏诊或误诊。

2．镜下检查：

显微镜下结核病病变通常为坏死性肉芽肿性炎，但亦可为非坏死性肉芽肿性炎。

典型的病变是肉芽肿伴干酪样坏死，外周有纤维结缔组织和慢性炎症细胞浸润，病变周边可见朗格汉斯巨细胞[6]。

结核病的基本病理变化主要为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变，这3种病变可以共存，随机体抵抗力、对MTB的变态反应强度、MTB的菌量及毒力强度而相互转化[4]。

需要注意的是，结核病的大体观察、组织学表现及细胞学表现虽然具有一定的特异性，但所有上述表现亦可出现在其他感染性和非感染性肉芽肿性病变中。

所以常规的病理学诊断手段并非结核病诊断的金标准，必须通过其他辅助检查找到结核病病原学依据方可确诊。

（二）特殊染色

1．抗酸染色：

抗酸染色是诊断结核病最常用的特殊染色方法。

由于MTB的细胞壁内含有大量脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。

但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。

最经典的抗酸染色方法是萋尼（Ziehl-Neelsen）染色法，现多用改良法。

油镜下MTB一般呈红染的两端钝圆稍弯曲的杆状，有时呈串珠状。

抗酸杆菌多见于坏死的中心区或坏死区与上皮样肉芽肿的交界处。

抗酸染色需要注意以下几点：

（1）除MTB外，麻风分枝杆菌（Mycobacteriumleprae）和非结核分枝杆菌（non-tuberculousmycobacteria，NTM）也是抗酸阳性杆菌，肉眼很难分辨，需要进一步进行分子病理检测或分枝杆菌培养加以鉴别。

（2）除分枝杆菌外，诺卡菌属（Nocardia）及军团菌属（Legionella）部分细菌也可呈抗酸染色阳性，应注意鉴别[7,8]。

（3）抗酸阳性率一般较低，抗酸阴性不能否定MTB的存在。

对于临床高度怀疑结核病的组织标本可适当制成厚切片（如10μm）进行抗酸染色，以提高阳性检出率。

（4）NTM是一类环境分枝杆菌，主要源于污水、土壤及气溶胶等，是造成抗酸染色假阳性的重要污染源。

如抗酸杆菌出现在非结核病病变区、组织外的玻片空白区或与组织不在同一个水平面时，需排除污染造成的假阳性。

（5）每次进行抗酸染色时需设阳性对照。

阅片需使用高倍镜和油镜，当高倍镜未发现阳性菌时，须使用油镜检查，以防假阴性。

2．网状纤维染色：

该染色显示组织结构是否完整、坏死的范围和程度。

凝固性坏死中网状纤维明显减少，在干酪样坏死中可完全消失。

由于干酪样坏死对于结核病具有一定的诊断价值，而仅通过HE染色对于坏死性质的判定可能出现一定的偏差，所以网状纤维染色对结核病的诊断和鉴别诊断有一定的帮助。

3．六胺银（GMS）及过碘酸盐希夫（PAS）染色：

真菌病是除结核病外最为常见的感染性肉芽肿疾病。

真菌病和结核病有时很难通过HE染色鉴别。

诊断真菌病需要在病变区找到真菌病原体。

GMS染色和PAS染色是最常用的识别真菌的染色方法。

这2种特殊染色虽然对于直接诊断结核病没有太大的价值，但却可起到与真菌病进行鉴别诊断的作用，有效防止误诊。

4．金安罗丹明染色：

与传统的抗酸染色法相比，金安罗丹明染色后抗酸杆菌会发出黄绿色荧光，在暗视野下更醒目，且可以在高倍镜下观察，不需要用油镜。

该方法与抗酸染色法相比操作和检测更方便，检出率更高。

但该方法需要紫外光源，较难对抗酸杆菌进行定位，同时荧光染色片无法长期保存。

（三）免疫组织化学染色免疫组织化学法（IHC）是利用抗原-抗体的特异性结合反应原理，以抗原或抗体检测和定位组织中目标蛋白质的一种技术方法。

结核病IHC染色主要使用两种类型的抗体，第一种类型是针对不同细胞类型的抗体，如抗CD68抗体可帮助区分类上皮细胞与上皮来源细胞，有助于确认肉芽肿结构，但对于结核病的诊断价值有限。

第二种类型是针对MTB特异抗原的抗体，这类抗体可在组织切片中显示MTB蛋白的表达，对结核病的诊断有帮助。

目前报道的抗体主要识别BCG成分、MPT64、PstS1及Ag85B等抗原[9,10,11,12]。

免疫组织化学检查操作简便，阳性信号易于观察，不需要使用油镜，可以有效提高敏感度和工作效率，但尚无可应用于临床诊断的第二种类型IHC抗体及结核病IHC的判读标准，需要开展更多的临床转化及评估研究。

（四）分子病理学检测近年来，分子病理学检测技术发展迅速。

基于基因检测的分子病理新技术具有简单、快捷、特异、敏感及快速等优点，可有效提高组织标本中MTB的检出率，可帮助鉴别结核病与非结核分枝杆菌病，还可以帮助诊断耐药结核病，为结核病病理学精准诊断提供了更多的辅助手段。

目前常用的技术如下。

1．实时荧光定量PCR技术：

实时荧光定量PCR（realtimefluorescencequantitativePCR）主要原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应软件对产物进行分析。

该技术是目前临床应用最为广泛的分子病理检测技术，其主要优势在于操作简便、成本低廉、快速及敏感等。

MTB特异序列IS6110是目前最常用的检测靶点，该序列只存在于MTB复合群，且是多拷贝，对于结核病诊断的敏感度和特异度较高，可用于鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病[13,14]。

2．核酸杂交技术：

核酸杂交（nucleicacidhybridization）技术主要原理是与探针（probe）具有一定同源性和互补性的待测核酸分子在一定的条件下，可与探针通过氢键形成双链分子。

这种双链分子经过同位素、荧光物质或生物素标记后，可通过放射自显影或显色反应检测出来。

该技术比PCR技术具有更高的检测通量，一次实验可以检测多个基因位点。

由于NTM种类繁多，而不同非结核分枝杆菌病治疗方案不尽相同，因此该技术在分枝杆菌菌种鉴定中具有独特优势。

另外，该技术可以实现一次检测多种抗结核药物的耐药相关基因突变，如通过检测rpoB基因突变筛选利福平耐药的MTB，通过检测katG、inhA、ahpC等基因突变可筛选异烟肼耐药的MTB等[15,16]。

3．高分辨熔解曲线技术：

高分辨熔解曲线（highresolutionmelting，HRM）技术主要原理是双链核酸分子热稳定性受其长度及碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中双链核酸分子解链行为的改变。

由于所用的荧光染料只能结合双链核酸分子，因此通过实时检测双链核酸分子熔解过程中荧光信号值的变化，再借助专业性的分析软件，可以检测待测核酸分子的序列多态性。

其特点是敏感度高、可检测单碱基差异、成本低且闭管操作等。

该技术也可应用于分枝杆菌菌种鉴定及耐药结核病的诊断[17,18]。

PCR的分子病理检测技术敏感度很高，外源DNA的污染容易造成假阳性，需要注意以下几点：

（1）分子病理检测需在符合国家标准的临床基因扩增实验室中，由受过专门培训的专业人员按照规范化操作规程进行，以保证检测结果的准确性。

（2）每次实验需设置阳性与阴性对照。

（3）当检测结果出现阴性时，不能排除由于病原菌数量低于检测限值而引起的假阴性结果。

（4）实验耗材尽量使用无核酸、无核酸酶、无菌的一次性用品，尽量使用带滤芯吸头，防止气溶胶对加样器的污染。

（5）建议分子病理检测使用专属切片机，不与其他常规切片机混用