干扰载体构建SOP.docx

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干扰载体构建SOP

shRNA干扰载体构建SOP

第一部分RNA干扰原理及shRNA设计

标准操作规程（SOP）

1.目的：

了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列

2.仪器与设备：

需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件（如PrimerPremier5）。

3.操作步骤

3.1RNA干扰原理

1）RNAi概述：

RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。

当细胞中导入与源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing）。

由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。

RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

2）RNAi原理：

RNA干扰包括起始阶段和效应阶段（inititationandeffectorsteps）。

在起始阶段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段（smallinterferingRNAs,siRNAs）。

证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs（siRNAs），每个片段的3’端都有2个碱基突出。

在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingplex,RISC）。

激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。

激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。

尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

3）RNAi示意图（见图1）

3.2shRNA设计

1）shRNA:

即shorthairpinRNA（短发卡RNA），包含两个短反向重复序列（其中一个与目的基因互补），中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。

shRNA在体可以被加工成siRNA从而降解目的基因.。

示意图见图2。

2）shRNA作用原理：

见图3。

3）shRNA设计原则：

●克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。

随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子；

●两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；

●StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因；

●在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；

●shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。

如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；

●ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。

不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。

其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。

在比较了众多不同长度和序列的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效（AMBIONuse）；

●5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录（stop）；

●在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的提前终止；

●从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。

正义链和反义链都采用这19个碱基（不包括AA或者NA重复）来设计。

图1RNAi原理

图2shRNA示意图图3shRNA作用原理

4）shRNA设计举例

●以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：

GCCGATGCATGTCTAAACT

●在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段：

BamHI靶点序列环结构靶点反义序列HindIII

GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA

GCGGCTACGTACAGATTTGAAAGTTCTCTTCAAATCTGTACGTAGCCGAAAAAATTCGA

●正反向Oligo序列分别为：

H-VEGFC-sh-F:

5’-GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA-3’

H-VEGFC-sh-R:

5’-AGCTTAAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGCG-3’

将该Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接与载体进行连接，构建shRNA干扰载体。

第二部分干扰载体pRNAT-U6.1概述

标准操作规程（SOP）

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS2：

干扰载体pRNAT-U6.1概述

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

1.目的：

了解干扰载体pRNAT-U6.1的特点

2.pRNAT-U6.1载体概述

●带有U6启动子，保证shRNA的高表达；

●带有GFP标签，可用于检测转染效率；

●带有多克隆位点；

●带有新霉素（Neomycin）抗性，可用于筛选稳定细胞株

3.pRNAT-U6.1载体图谱

图1pRNAT-U6.1载体图谱

第三部分酶切与回收

标准操作规程（SOP）

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS3：

酶切与回收

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

1.目的：

通过酶切可以获得带酶切位点的线性化质粒载体，使用试剂盒对其进行回收。

2.试剂与材料

名称

公司

货号

限制性切酶

Thermo

1.5mLtube

Axygen

0.2mLPCRtube

Axygen

CyclePureKit

OMEGA

D6492-01

3.仪器与设备

名称

公司

货号

MAXYGENEThermalCycler

Axygen

MaxyGeneGradient

移液器

大龙

掌上离心机

其林贝尔

LX-200

恒温水浴锅

精宏

DK-80

4.操作步骤

4.1酶切

以Thermo切酶为例，准备好冰盒，将所需试剂从冰箱中取出后置于冰上，待试剂融化后，在0.2mL离心管中加入：

10×bufferTango5μL

切酶HindIII1μL

切酶BamHI1μL

shRNA干扰质粒pNAT-U6.11μg

ddH2Oupto50μL

盖紧管盖，离心15s。

将0.2mL离心管置于离心管架上，放入37℃水浴锅中，酶切1h（时间长短根据酶的反应效率而异，可参考产品说明书）。

也可以直接使用PCR仪进行酶切反应。

Notes:

●根据酶的特点，可能要求用到BSA，可根据说明书进行操作。

双酶切时，如果仅其中一种酶需要用到BSA，则也需要在酶切体系中加入BSA，因为BSA不会影响切酶的活性。

●若两个位点的切酶使用相同缓冲液（即在该种缓冲液里酶活性最高），可加入两种酶同时进行反应

●若使用不同缓冲液，则可先进行单酶切，回收后再进行第二次酶切，再次回收。

●由于载体上的两个酶切位点一般相距较近，有些酶需要更多的保护碱基，则同时进行双酶切可能效率不高。

可先加入需要更多保护碱基（或是酶切效率较低）的切酶，反应结束后回收（如果两种酶使用同一类缓冲液，则可省去回收步骤），再加入第二种酶进行反应。

酶切后的载体通过凝胶电泳分离然后回收纯化，去除切割下来的小片段，从而降低假阳性。

4.2酶切产物回收

以OMEGACyclePureKit试剂盒为例。

1）将酶切产物转移至1.5mL离心管，加入4-5倍酶切产物体积的BufferCP；如果PCR片段长度小于200bp，则加入6倍体积的BufferCP；

2）漩涡震荡混匀，短暂离心，收集管壁上的液体；

3）将混合物加入至试剂盒提供的HiBindDNA吸附柱，10000g，室温离心1min；

4）弃残液，加入700μLDNAWASHBuffer，10000g，室温离心1min；

5）重复步骤4；

6）弃残液后，13000，室温离心2min；

7）将HiBindDNA吸附柱置于干净的1.5mL离心管，加入15-30μLElutionBuffer或ddH2O，室温放置1-2min，13000，室温离心2min，收集DNA产物。

第四部分退火与连接

标准操作规程（SOP）

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS4：

退火与连接

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

1.目的：

将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链DNA片段，随后连接至酶切后的载体。

2.试剂与材料：

名称

公司

货号

5×退火缓冲液

自制

shRNAOligo片段

华大基因

ddH2O

自制

0.2mLPCRTube

Axygen

pRNAT-U6.1/Neo质粒载体

金斯瑞

T4ligase

康为生物

CW0805

3.仪器与设备

名称

公司

货号

离心机

Thermo

PICO17

掌上离心机

其林贝尔

LX-200

MAXYGENEThermalCycler

Axygen

MaxyGeneGradient

移液器

大龙

4.操作步骤

4.1退火

1）按下表配制5×退火缓冲液：

成分

终浓度

Tris

50mM（pH8.0）

NaCl

250mM

EDTA

5mM

2）将合成好的Oligo片段用蒸馏水溶解稀释至100μM，在0.2mL离心管中按下表加入各成分：

OligoF（100μM）

4μL

OligoR（100μM）

4μL

5×退火缓冲液

2μL

3）一共10μL，短暂离心后将液体收集至管底，放入PCR仪中，执行以下程序：

95℃5min

80℃4min

75℃4min

70℃4min

65℃2min

60℃2min

55℃2min

50℃2min

45℃2min

40℃2min

37℃2min

20℃20min

程序结束后，可4℃短时间保存，或-20℃长期保存。

4.3连接

由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进行连接。

退火后的混合物稀释10倍，使用1~10μL移液枪在0.2mL离心管中加入：

10×buffer1μL

T4DNAligase0.1μL

退火混合物（已稀释10倍）1μL

酶切后载体pRNAT-U6.13μL

H2Oupto10μL

一共10μL，轻微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s，PCR仪上22℃反应30min。

第五部分转化与涂平板

标准操作规程（SOP）

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS5:

转化与涂平板

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

1.目的：

将连接好的质粒转化大肠杆菌，然后涂平板进行筛选。

2.试剂与材料

名称

公司

货号

DH5α

博迈德

琼脂糖

Biowest

琼脂粉

BIOSHARP

氨苄青霉素

Axygen

胰化蛋白胨

OXOID

L42

酵母提取物

OXOID

LP0021

NaCl

汇虹

一次性使用培养皿

堰市为尔康医用品公司

1.5mLtube

Axygen

0.2mLPCRtube

Axygen

3.仪器与设备

名称

公司

货号

恒温摇床

浦东物理化学仪器厂

THZ-92C

移液器

大龙

掌上离心机

其林贝尔

LX-200

恒温水浴锅

精宏

DK-80

净化工作台

净化

SW-CJ-2D

磁力加热搅拌器

湘仪

78-1

4.操作步骤

4.1配制LB培养基

♦液体LB培养基：

在大烧杯中加入900ml去离子水，称取以下试剂加入烧杯中：

胰化蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl10g

用搅拌器搅拌混匀，直至全部溶解。

用去离子水定容至1L，121℃高温蒸汽灭菌20min。

♦固体LB培养基：

配置好液态LB培养基后，加入琼脂粉至终浓度1.5%，121℃高温蒸汽灭菌20min。

4.2转化

插入片段和载体连接后，可直接进行转化。

1）打开水浴锅，调至42℃。

准备好冰盒，将装有大肠杆菌感受态细胞DH5α（100μL）的1.5mL离心管从-80℃冰箱中取出，迅速置于冰上；

2）待感受态细胞完全融化后，用1~10μL移液枪将10μL连接产物加入1.5mL离心管中，轻微混匀（动作需轻柔），置于冰上30min；

3）将1.5mL离心管置于42℃水浴锅，热激90s，然后迅速取出，置于冰上5min；

4）超净台中操作，在离心管中加入890μL不含抗生素的LB培养基，置于37℃摇床上，200rpm震荡培养45min；

5）超净台中操作，取100μL转化液涂布于含抗生素（如氨卞）的LB平板培养基，置于37℃孵箱，过夜培养。

设置对照：

♦对照A．将双酶切后的载体质粒直接进行连接反应（不加插入片段），然后进行转化。

这个对照可检测双酶切是否完全。

如果长出克隆，说明双酶切不完全，部分质粒完全没有酶切或只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切完全。

♦对照B．载体双酶切后，不进行连接反应，直接进行转化。

如果长出克隆，说明有残留的未被任何酶切的原始质粒。

♦对照C：

将未酶切的原始质粒直接进行转化，验证转化过程的正确性。

如果长出大量克隆，说明转化成功，否则视为转化失败。

♦对照D：

取20μL感受态细胞直接涂布于不含有抗生素的LB平板上，检测感受态细胞的活性。

如果长出大量克隆，说明感受态细胞活性好。

4.3涂平板

1）倒平板：

将装有固体LB培养基的三角瓶（去掉封口膜）放入微波炉，加热使培养基融化，取出后冷却至55℃左右（手可触摸），在超净台操作，加入抗生素（如氨苄青霉素，终浓度100μg/mL），并充分摇匀。

将培养基分装倒入一次性细菌培养皿，每个约10mL，室温冷却凝固。

可将培养皿用parafilm封口后，倒置放入4℃冰箱保存备用。

2）用移液器吸取100μL菌液滴至固体培养基表面，用弯曲的玻璃棒（事先酒精灯灼烧后冷却）将菌液涂布均匀，待菌液吸收干燥后，将培养皿置于37℃恒温箱，倒置培养（倒有培养基的一面在上）。

Notes:

以上需在超净工作台中操作，实验结束后及时清理工作台面。

倒平板时，一定要在培养基冷却后再加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效。

第六部分挑菌与菌液PCR

标准操作规程（SOP）

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS6:

挑菌与菌液PCR

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

1.目的

挑取菌落克隆培养，用菌液直接进行PCR，鉴定目的片段是否已插入载体。

2.试剂与材料

名称

公司

货号

琼脂糖

Biowest

琼脂粉

BIOSHARP

氨苄青霉素

Axygen

胰化蛋白胨

OXOID

L42

酵母提取物

OXOID

LP0021

NaCl

汇虹

一次性使用培养皿

堰市为尔康医用品公司

1.5mLtube

Axygen

0.2mLPCRtube

Axygen

HSMix

东盛生物

P2082

DNAmarker

东盛生物

3.仪器与设备

名称

公司

货号

恒温摇床

浦东物理化学仪器厂

THZ-92C

移液器

大龙

掌上离心机

其林贝尔

LX-200

恒温水浴锅

精宏

DK-80

净化工作台

净化

SW-CJ-2D

磁力加热搅拌器

湘仪

78-1

MAXYGENEThermalCycler

Axygen

MaxyGeneGradient

4.操作步骤

1.挑菌

1）待平板的菌落长至足够大达到可挑的水平（肉眼可见，直径约0.5mm以上）；

2）准备好若干个1.5mL离心管，各加入500uL含抗生素的LB培养基；

3）用镊子夹取灭菌的牙签（或10μL枪头）挑取平板上的单菌落，在离心管的培养基中蘸洗几下，盖紧管盖后再将牙签丢弃于台外的收集箱中（若用10μL枪头，可将枪头留在离心管）；

4）接种过菌落的离心管在37℃摇床中振荡培养，摇速250rpm；注意试管要在摇床上放好，有适当的倾斜角度（45°左右）。

Notes:

以上需在超净工作台中操作，实验结束后及时清理工作台面。

2.菌液PCR

1）挑取菌落在37℃摇床培养4-5h至培养基呈浑浊状后，将离心管取出，取1μL；

2）在0.2mL离心管中加入：

HSPCRmix10μL

Forwardprimer（10uM）1μL

Reverseprimer（10uM）1μL

菌液1μL

ddH2O7μL

3）一共10uL，轻微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s。

打开PCR仪，将离心管置于PCR仪上，盖紧保护盖，PCR程序设置如下：

95℃10min

30cycles

95℃30s

55℃30s（退火温度根据引物Tm值不同而定）

72℃30s（延伸时间随目的产物长度及酶的合成效率不同而定）

72℃7min

4）PCR程序结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，有目的条带的克隆即可送公司进行测序鉴定。

测序正确则说明载体构建成功，可将该克隆扩大培养，提取质粒，以待后续试验使用。

第七部分质粒提取

标准操作规程（SOP）

实验名称

shRNA干扰载体构建SOPS7:

质粒提取

起草人／修订人

何章荣

修订日期

2015.7

审核人

审核日期

批准人

批准日期

颁发部门

1.目的

从菌液中提取质粒，以供下游实验（酶切，转染等）使用。

2.试剂与材料

名称

公司

货号

高纯度质粒小提中量试剂盒

天根生物

DP107

无毒素质粒大提试剂盒

天根生物

DP117

异丙醇

汇虹

无水乙醇

汇虹

50ml离心管

琼脂粉

BIOSHARP

氨苄青霉素

Amresco

0339

胰化蛋白胨

OXOID

L42

酵母提取物

OXOID

LP0021

NaCl

汇虹

3.仪器与设备

名称

公司

货号

恒温摇床

浦东物理化学仪器厂

THZ-92C

移液器

大龙

掌上离心机

其林贝尔

LX-200

恒温水浴锅

精宏

DK-80

净化工作台

净化

SW-CJ-2D

磁力加热搅拌器

湘仪

78-1

离心机

Thermo

PICO17

高速冷冻离心机

湘仪

H2050R

4.操作步骤

4.1质粒小提

以天根公司试剂盒“高纯度质粒小提中量试剂盒（DP107）”为例：

1）柱平衡步骤：

向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）

2）取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，尽量吸除上清。

注意：

菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。

3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：

请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4）向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：

温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。

此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。

如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5）向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12,000rpm（~13,400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：

P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6）将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000rpm（~13,400×g）离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中），（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。

7）12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

向吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

8）向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

注意：

加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5min，有助于更好地去除杂质。

9）重复操作步骤9。

10）将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000rpm（~13,400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：

漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11）将吸附柱CP4置于一个干净的