干扰载体构建SOP.docx

1、干扰载体构建SOPshRNA干扰载体构建SOP第一部分 RNA干扰原理及shRNA设计标准操作规程(SOP)1.目的：了解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列2.仪器与设备：需要能够连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5)。3.操作步骤3.1RNA干扰原理1)RNAi概述： RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与源性m

2、RNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。2)RNAi原理：RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰

3、RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因,病毒感染等各种方式引入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing plex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录

4、体上，并在距离siRNA 3端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。3)RNAi示意图(见图1)3.2shRNA设计1)shRNA: 即short hairpin RNA(短发卡RNA) ，包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。shRNA在体可以被加工成siRNA从而降解目的基因.。示意图见图2。2)shRNA作用原理：见图3。3)shRNA设计原则：克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发

5、夹结构，由pol启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶的转录终止子；两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因；在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA插入片段的克隆。在比

6、较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列最为有效(AMBION use)；5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)；在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的提前终止；从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。图1 RNAi原理图2 shRNA示意图图3 shRNA作用原理4)shRNA设计举例以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：GCCGAT

7、GCATGTCTAAACT在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段：BamH I 靶点序列环结构靶点反义序列Hind IIIGATCC GCCGATGCATGTCTAAACT TTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA G CGGCTACGTACAGATTTGA AAGTTCTCT TCAAATCTGTACGTAGCCGAAAAAA TTCGA正反向Oligo序列分别为：H-VEGFC-sh-F:5-GATCCGCCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTA-3H-VEGFC-sh-

8、R:5-AGCTTAAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGCG-3将该Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接与载体进行连接，构建shRNA干扰载体。第二部分干扰载体pRNAT-U6.1概述标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S2：干扰载体pRNAT-U6.1概述起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1.目的：了解干扰载体pRNAT-U6.1的特点2.pRNAT-U6.1载体概述带有U6启动子，保证shRNA的高表达；带有GFP标签，可用于检测转染效率；带有多克隆位点

9、；带有新霉素(Neomycin)抗性，可用于筛选稳定细胞株3.pRNAT-U6.1载体图谱图1 pRNAT-U6.1载体图谱第三部分酶切与回收标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S3：酶切与回收起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1.目的：通过酶切可以获得带酶切位点的线性化质粒载体，使用试剂盒对其进行回收。2.试剂与材料名称公司货号限制性切酶Thermo1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenCycle Pure Kit OMEGAD6492-013.仪器与设备名称公司货号MAXYGENE Therm

10、al CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-804.操作步骤4.1酶切以Thermo切酶为例，准备好冰盒，将所需试剂从冰箱中取出后置于冰上，待试剂融化后，在0.2mL离心管中加入：10buffer Tango 5L切酶HindIII 1L切酶BamHI 1L shRNA干扰质粒pNAT-U6.1 1g ddH2O up to 50L盖紧管盖，离心15s。将0.2mL离心管置于离心管架上，放入37水浴锅中，酶切1h(时间长短根据酶的反应效率而异，可参考产品说明书)。也可以直接使用PCR仪进行酶切反应。Notes:根据酶

11、的特点，可能要求用到BSA，可根据说明书进行操作。双酶切时，如果仅其中一种酶需要用到BSA，则也需要在酶切体系中加入BSA，因为BSA不会影响切酶的活性。若两个位点的切酶使用相同缓冲液(即在该种缓冲液里酶活性最高)，可加入两种酶同时进行反应若使用不同缓冲液，则可先进行单酶切，回收后再进行第二次酶切，再次回收。由于载体上的两个酶切位点一般相距较近，有些酶需要更多的保护碱基，则同时进行双酶切可能效率不高。可先加入需要更多保护碱基(或是酶切效率较低)的切酶，反应结束后回收(如果两种酶使用同一类缓冲液，则可省去回收步骤)，再加入第二种酶进行反应。酶切后的载体通过凝胶电泳分离然后回收纯化，去除切割下来的

12、小片段，从而降低假阳性。4.2酶切产物回收以OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒为例。1)将酶切产物转移至1.5mL 离心管，加入4-5倍酶切产物体积的Buffer CP；如果PCR片段长度小于200bp，则加入6倍体积的Buffer CP；2)漩涡震荡混匀，短暂离心，收集管壁上的液体；3)将混合物加入至试剂盒提供的HiBind DNA吸附柱，10000g，室温离心1min；4)弃残液，加入700L DNA WASH Buffer，10000g，室温离心1min；5)重复步骤4；6)弃残液后，13000，室温离心2min；7)将HiBind DNA吸附柱置于干净的1.5mL 离心管，

13、加入15-30L Elution Buffer或ddH2O，室温放置1-2min，13000，室温离心2min，收集DNA产物。第四部分退火与连接标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S4：退火与连接起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1.目的：将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链DNA片段，随后连接至酶切后的载体。2.试剂与材料：名称公司货号5退火缓冲液自制shRNA Oligo片段华大基因ddH2O自制0.2mL PCR TubeAxygenpRNAT-U6.1/Neo质粒载体金斯瑞T4 ligase康为生物CW0805

14、3.仪器与设备名称公司货号离心机ThermoPICO 17掌上离心机其林贝尔LX-200MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龙4.操作步骤4.1退火1)按下表配制5退火缓冲液：成分终浓度Tris50mM (pH 8.0)NaCl250mMEDTA5mM2)将合成好的Oligo片段用蒸馏水溶解稀释至100M，在0.2mL 离心管中按下表加入各成分：Oligo F (100M)4LOligo R (100M)4L5退火缓冲液2L3)一共10L，短暂离心后将液体收集至管底，放入PCR仪中，执行以下程序：95 5min80 4min75 4

15、min70 4min65 2min60 2min55 2min50 2min45 2min40 2min37 2min 20 20min程序结束后，可4短时间保存，或-20长期保存。4.3连接由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进行连接。退火后的混合物稀释10倍，使用1 10 L移液枪在0.2mL离心管中加入： 10buffer 1L T4 DNA ligase 0.1L退火混合物(已稀释10倍) 1L酶切后载体 pRNAT-U6.1 3L H2O up to 10L一共10L，轻微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s，PCR仪上22反应30min。第五部分转化与涂平板标

16、准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S5: 转化与涂平板起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1.目的：将连接好的质粒转化大肠杆菌，然后涂平板进行筛选。2.试剂与材料名称公司货号DH5博迈德琼脂糖Biowest琼脂粉BIOSHARP氨苄青霉素Axygen胰化蛋白胨OXOIDL42酵母提取物OXOIDLP0021NaCl汇虹一次性使用培养皿堰市为尔康医用品公司1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygen3.仪器与设备名称公司货号恒温摇床浦东物理化学仪器厂THZ-92C移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温

17、水浴锅精宏DK-80净化工作台净化SW-CJ-2D磁力加热搅拌器湘仪78-14.操作步骤4.1配制LB培养基液体LB培养基：在大烧杯中加入900 ml去离子水，称取以下试剂加入烧杯中：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5g NaCl 10g用搅拌器搅拌混匀，直至全部溶解。用去离子水定容至1L，121高温蒸汽灭菌20min。固体LB培养基：配置好液态LB培养基后，加入琼脂粉至终浓度1.5%，121高温蒸汽灭菌20min。4.2转化插入片段和载体连接后，可直接进行转化。1)打开水浴锅，调至42。准备好冰盒，将装有大肠杆菌感受态细胞DH5(100L)的1.5mL离心管从-80冰箱中取出，迅速置于冰上；2

18、)待感受态细胞完全融化后，用1 10 L移液枪将10L连接产物加入1.5mL离心管中，轻微混匀(动作需轻柔)，置于冰上30min；3)将1.5mL离心管置于42水浴锅，热激90s，然后迅速取出，置于冰上5min；4)超净台中操作，在离心管中加入890L不含抗生素的LB培养基，置于37摇床上，200rpm震荡培养45min；5)超净台中操作，取100L转化液涂布于含抗生素(如氨卞)的LB平板培养基，置于37孵箱，过夜培养。设置对照：对照A将双酶切后的载体质粒直接进行连接反应(不加插入片段)，然后进行转化。这个对照可检测双酶切是否完全。如果长出克隆，说明双酶切不完全，部分质粒完全没有酶切或只进行了

19、单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切完全。对照B载体双酶切后，不进行连接反应，直接进行转化。如果长出克隆，说明有残留的未被任何酶切的原始质粒。对照C：将未酶切的原始质粒直接进行转化，验证转化过程的正确性。如果长出大量克隆，说明转化成功，否则视为转化失败。对照D：取20L感受态细胞直接涂布于不含有抗生素的LB平板上，检测感受态细胞的活性。如果长出大量克隆，说明感受态细胞活性好。4.3涂平板1)倒平板：将装有固体LB培养基的三角瓶(去掉封口膜)放入微波炉，加热使培养基融化，取出后冷却至55左右(手可触摸)，在超净台操作，加入抗生素(如氨苄青霉素，终浓度100g/mL)，并充分摇匀。将培养基分装倒入一

20、次性细菌培养皿，每个约10mL，室温冷却凝固。可将培养皿用parafilm封口后，倒置放入4冰箱保存备用。2)用移液器吸取100L菌液滴至固体培养基表面，用弯曲的玻璃棒(事先酒精灯灼烧后冷却)将菌液涂布均匀，待菌液吸收干燥后，将培养皿置于37恒温箱，倒置培养(倒有培养基的一面在上)。Notes:以上需在超净工作台中操作，实验结束后及时清理工作台面。倒平板时，一定要在培养基冷却后再加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效。第六部分挑菌与菌液PCR标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S6: 挑菌与菌液PCR起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发

21、部门1.目的挑取菌落克隆培养，用菌液直接进行PCR，鉴定目的片段是否已插入载体。2.试剂与材料名称公司货号琼脂糖Biowest琼脂粉BIOSHARP氨苄青霉素Axygen胰化蛋白胨OXOIDL42酵母提取物OXOIDLP0021NaCl汇虹一次性使用培养皿堰市为尔康医用品公司1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenHS Mix 东盛生物P2082DNA marker 东盛生物3.仪器与设备名称公司货号恒温摇床浦东物理化学仪器厂THZ-92C移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-80净化工作台净化SW-CJ-2D磁力加热搅拌器湘仪78-1MA

22、XYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient4.操作步骤1.挑菌1)待平板的菌落长至足够大达到可挑的水平(肉眼可见，直径约0.5mm以上)；2)准备好若干个1.5mL离心管，各加入500uL含抗生素的LB培养基；3)用镊子夹取灭菌的牙签(或10L枪头)挑取平板上的单菌落，在离心管的培养基中蘸洗几下，盖紧管盖后再将牙签丢弃于台外的收集箱中(若用10L枪头，可将枪头留在离心管)；4)接种过菌落的离心管在37摇床中振荡培养，摇速250rpm；注意试管要在摇床上放好，有适当的倾斜角度（45左右）。Notes:以上需在超净工作台中操作，实验结束后及时清理工作台面

23、。2.菌液PCR1)挑取菌落在37摇床培养4-5h至培养基呈浑浊状后，将离心管取出，取1L；2)在0.2mL离心管中加入：HS PCR mix 10L Forward primer(10uM) 1L Reverse primer(10uM) 1L 菌液 1LddH2O 7L3)一共10uL，轻微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s。打开PCR仪，将离心管置于PCR仪上，盖紧保护盖，PCR程序设置如下：95 10min 30 cycles95 30s55 30s (退火温度根据引物Tm值不同而定)72 30s(延伸时间随目的产物长度及酶的合成效率不同而定)72 7min 4)PCR程序结束后，琼脂糖凝

24、胶电泳检测PCR结果，有目的条带的克隆即可送公司进行测序鉴定。测序正确则说明载体构建成功，可将该克隆扩大培养，提取质粒，以待后续试验使用。第七部分质粒提取标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S7: 质粒提取起草人修订人何章荣修订日期2015.7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1.目的从菌液中提取质粒，以供下游实验(酶切，转染等)使用。2.试剂与材料名称公司货号高纯度质粒小提中量试剂盒天根生物DP107无毒素质粒大提试剂盒天根生物DP117异丙醇汇虹无水乙醇汇虹50ml离心管琼脂粉BIOSHARP氨苄青霉素Amresco0339胰化蛋白胨OXOIDL42酵母提取物OX

25、OIDLP0021NaCl汇虹3.仪器与设备名称公司货号恒温摇床浦东物理化学仪器厂THZ-92C移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-80净化工作台净化SW-CJ-2D磁力加热搅拌器湘仪78-1离心机ThermoPICO 17高速冷冻离心机湘仪H2050R4.操作步骤4.1质粒小提以天根公司试剂盒“高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)”为例：1)柱平衡步骤：向吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）加入500 L的平衡液BL，12,000 rpm (13,400g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）2)取5-15 m

26、l过夜培养的菌液加入离心管中，12,000 rpm (13,400g ) 离心1 min，尽量吸除上清。注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。3)向留有菌体沉淀的离心管中加入500 L溶液P1 （请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。4)向离心管中加入500 L溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变

27、得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5)向离心管中加入700 L溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (13,400g ) 离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。6)将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12,000 rpm (13,400g )离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）

28、，（如果过滤柱中有残余的液体说明步骤5吸取的上清中杂质过多，可以延长离心的时间；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取上清）。7)12,000 rpm (13,400g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。向吸附柱CP4中加入500 L去蛋白液PD，12,000 rpm (13,400g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。8)向吸附柱CP4中加入600 L漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。9)重复操作步骤9。10)将吸附柱CP4重新放回收集管中置于12,000 rpm (13,400g ) 离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11)将吸附柱CP4置于一个干净的