RNA干扰-_精品文档.ppt

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RNA干扰技术董燕广州中医药大学临床药理研究所免疫研究室分子生物学技术实验室非编码非编码RNA（non-codingRNA,ncRNA）RNA（non-codingRNA,ncRNA）不被翻译成蛋白质的一类小RNA,长度一般为2025个核苷酸（nucleotide,nt）,转录ncRNA的DNA序列叫非编码RNA基因。

没有编码蛋白质的功能,但参与蛋白质翻译过程,是RNA实现功能的关键分子。

小干扰小干扰RNA（shortinterferingRNA，siRNA），小双链，小双链RNA微小微小RNA（microRNA,miRNA），单链小分子，单链小分子RNA长链非编码长链非编码RNA（LncRNA），长度超过，长度超过200nt，调控基，调控基因表达。

因表达。

1.RNA干扰的发现和命名RNAiRNAi的发现源于转基因植物的研究和反义的发现源于转基因植物的研究和反义RNARNA的的研究。

研究。

19901990年，年，NapoliNapoli和和StuijeStuije在转基因植物中首次发在转基因植物中首次发现现转录后基因沉默转录后基因沉默（PTGSPTGS）。

）。

在向矮牵牛花导入合成花青素的关键酶（苯基乙烯酮合在向矮牵牛花导入合成花青素的关键酶（苯基乙烯酮合成酶）的基因时，出人意料的是，部分花的颜色没有变成酶）的基因时，出人意料的是，部分花的颜色没有变的更紫，呈现白色或杂斑色。

是内源性同源基因沉默或的更紫，呈现白色或杂斑色。

是内源性同源基因沉默或受到抑制的结果，称其为受到抑制的结果，称其为共抑制共抑制（cosuppression）。

）。

转录后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHSGeneCHSGene矮牵牛花矮牵牛花1995年，年，Dr.SuGuo等在进行等在进行反义反义RNA阻断线虫的阻断线虫的par-1基因表达时发现正义基因表达时发现正义RNA抑制基因表达的现象，是由于抑制基因表达的现象，是由于污染微量污染微量双链双链RNA引起。

引起。

向线虫体内注射双链向线虫体内注射双链RNA可导致可导致mRNA的特异性降解。

的特异性降解。

将由双链将由双链RNA引起的特异性基因抑制现象称作引起的特异性基因抑制现象称作RNA干扰干扰。

1998年，年，Fire和和Mello等证明了上述现象属于等证明了上述现象属于转录后水平转录后水平的基因沉默的基因沉默机制（机制（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS），并由此提出），并由此提出RNAinterference的概念。

的概念。

2.RNA干扰的定义RNARNA干扰（干扰（RNAinterference,RNAiRNAinterference,RNAi）现象是指内源）现象是指内源性或外源性小性或外源性小RNARNA介导的细胞内介导的细胞内mRNAmRNA发生发生特异性降解特异性降解或抑制翻译，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功或抑制翻译，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。

这一现象属于转录后的基因沉默机制能表型缺失。

这一现象属于转录后的基因沉默机制（Posttranscriptionalgenesilencing,PTGSPosttranscriptionalgenesilencing,PTGS）。

）。

2006年，安德鲁法厄（AndrewZ.Fire）与克雷格梅洛（CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。

传统的基因沉默技术基因敲除（基因敲除（geneknockoutgeneknockout）肽核酸（肽核酸（peptidenucleicacidpeptidenucleicacid，PNAPNA）siRNA:

siRNA:

是指能够针对某一基因引起特异性基因沉是指能够针对某一基因引起特异性基因沉默的小的双链默的小的双链RNARNA分子分子（smallinterferingRNA）（smallinterferingRNA）人工合成或载体表达人工合成或载体表达RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因可能导致细胞中出现双链录等原因可能导致细胞中出现双链RNA（dsRNA）。

3.RNAi3.RNAi的机制的机制

（1）siRNA

（1）siRNA形成阶段形成阶段

（2）RNA

（2）RNA诱导的沉默复合物诱导的沉默复合物（RISCRISC）形成阶段）形成阶段（3）（3）效应阶段效应阶段（4）（4）扩增阶段扩增阶段（11）siRNAsiRNA形成阶段形成阶段外源或内源双链外源或内源双链dsRNAdsRNA激活激活DicerDicer酶。

酶。

DicerDicer酶（复合物）由双链酶（复合物）由双链RNARNA特异性核酸内切酶和特异性核酸内切酶和解旋酶等组成的酶复合物，识别双链解旋酶等组成的酶复合物，识别双链RNARNA并切割成并切割成20-20-24nt24nt短双链短双链RNARNA（一般为（一般为22nt22nt），即），即siRNAsiRNA。

（22）RNARNA诱导的沉默复合物形成阶段诱导的沉默复合物形成阶段此阶段主要是生成的此阶段主要是生成的siRNAsiRNA与与RNARNA特异性酶（特异性酶（DicerDicer酶）酶）结合，形成结合，形成RISCRISC（RNA-inducedsilencingcomplexRNA-inducedsilencingcomplex），），具有序列特异性的核酸内切酶活性，能特异性降解与具有序列特异性的核酸内切酶活性，能特异性降解与siRNAsiRNA同源的靶同源的靶mRNAmRNA。

（33）效应阶段）效应阶段RISCRISC中中siRNAsiRNA变性，双链解开，卸下正义链，反义链变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在复合物上，并引导仍结合在复合物上，并引导RISCRISC与同源的与同源的mRNAmRNA结合，结合，在核酸内切酶的作用下，将靶在核酸内切酶的作用下，将靶mRNAmRNA切断。

切断。

（44）扩增阶段）扩增阶段以以siRNAsiRNA的一条链为引物，以靶的一条链为引物，以靶mRNAmRNA为模板，在为模板，在RNARNA介导的介导的RNARNA聚合酶的作用下，扩增靶聚合酶的作用下，扩增靶mRNAmRNA，产生新的，产生新的siRNAsiRNA亚群。

亚群。

RNAiRNAi的实验的实验操作流程操作流程两两种种方方法法实实现现途途径径示示意意图图1、siRNA的设计2、siRNA的制备方法体外合成法

（1）化学合成法使用DNA/RNA合成仪进行化学合成。

（2）体外转录合成法构建载体进行体外转录合成。

体内合成法使用各种表达载体进行生物体内合成。

阴性对照阴性对照和选中的和选中的siRNAsiRNA序列有相同的组成，但是和序列有相同的组成，但是和mRNAmRNA没有明没有明显的同源性。

显的同源性。

通常的做法是将选中的通常的做法是将选中的siRNAsiRNA序列打乱，即序列打乱，即scramblescramblesiRNAsiRNA。

要保证它和靶细胞中其他基因没有同源性。

要保证它和靶细胞中其他基因没有同源性。

3、siRNA的转染4、基因沉默效果的检查qRT-PCR检查mRNA的量。

Westernblot检查该基因表达的蛋白的量的变化。

形态学、功能、性状的改变4.RNAi4.RNAi技术的应用技术的应用基因功能的研究基因功能的研究可可作作为为逆逆向向遗遗传传学学（ReverseReversegenetics）genetics）的的研研究究手手段段,分析基因组的未知基因功能。

分析基因组的未知基因功能。

发育生物学的研究发育生物学的研究RNAiRNAi参与胚胎发育的生物学功能。

参与胚胎发育的生物学功能。

基因治疗（新药研发）基因治疗（新药研发）RNAiRNAi基因敲除基因敲除5.miRNA，microRNAmiRNA在真核细胞中普遍存在。

内源性RNAi现象miRNA调控基因表达是内源性的翻译抑制因子。

是由内源性发夹（hairpin）结构转录产物衍生而来的一种长约1925nt的单链。

miRNA基因在基因组中分布广泛，可位于基因基因在基因组中分布广泛，可位于基因组的非编码区，以及编码蛋白质基因的内含子、组的非编码区，以及编码蛋白质基因的内含子、外显子和非翻译区。

外显子和非翻译区。

这些基因在基因组中成簇排列或分散排列。

这些基因在基因组中成簇排列或分散排列。

位于基因间隔区的位于基因间隔区的miRNA基因可独立进行转录。

基因可独立进行转录。

miRNA基因在核内由基因在核内由RNA聚合酶聚合酶II转录而来转录而来,初产物是初产物是pri-miRNA,具有具有1个或多个茎环结构。

经剪切成包含茎个或多个茎环结构。

经剪切成包含茎环结构的前体环结构的前体pre-miRNA，由细胞核进入到细胞质，由细胞核进入到细胞质,被被Dicer（核酸酶）切割成约（核酸酶）切割成约22nt的双链。

的双链。

该双链迅速被引入沉默复合体该双链迅速被引入沉默复合体（RISC，RNA-inducedsilencingcomplex）中中,其中一条成熟的单链其中一条成熟的单链miRNA保留保留在这一复合体中。

在这一复合体中。

成熟的单链成熟的单链miRNA识别识别mRNA上的靶位点并引导上的靶位点并引导RISC沉默复合体切割沉默复合体切割mRNA或抑制其翻译。

或抑制其翻译。

转录产物转录产物pri-miRNApre-miRNAmiRNADroshaDicer表达抑制表达抑制maturemiRNA解析解析miRNA的的形成过程形成过程研究与细胞的发生、分化、研究与细胞的发生、分化、增殖、凋亡、压力应答等的关系增殖、凋亡、压力应答等的关系核糖核酸酶核糖核酸酶miRNA主要通过与靶mRNA的的碱基互补配对而起作用。

引起靶mRNA的剪切或者翻译的抑制。

当其与mRNA不完全配对时,抑制翻译过程;完全配对时,则切割或降解。

这种作用机制在各物种间比较保守,且在机体的基因表达调控网络中具有时空特异性。

基因功能分析利用转基因模型研究特定基因功能细胞、动物、植物利用基因敲除模型研究基因功能通过抑制或沉默基因表达RNA干扰谢谢！