桂芍散结丸质量标准研究Word格式.docx

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为了有效控制本制剂质量，保证临床疗效，笔者对方中的红花、黄柏进行了显微鉴别，对王不留行、赤芍、醋延胡索、黄柏药材进行了薄层色谱鉴别，并用高效液相法测定赤芍中芍药苷的含量。

1 

仪器与试药

奥林巴斯BX53型生物显微镜；

GOODLOOK-1000薄层色谱成像系统；

岛津LC-20A高效液相色谱仪；

MS205DU梅特勒电子天平；

KS-500EI超声波清洗机；

真空脱气器；

DP-01无油真空泵。

芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，11）；

王不留行对照药材（中国食品药品检定研究院，12）；

延胡索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，11）；

盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，11）；

桂芍散结丸供试品（批号141011、141111、141212）及其相应阴性样品均由淄博市中医医院提供；

硅胶G薄层板（Merck公司）；

乙腈（天津科密欧，色谱纯）；

甲醇（天津康科德，色谱纯）；

磷酸（上海安谱科学仪器有限公司，色谱纯）；

水为娃哈哈纯净水；

其他试剂均为分析纯。

2 

方法与结果

2.1 

显微鉴别

取本品粉末，置显微镜下观察：

黄柏纤维鲜黄色，直径16～38μm，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶鞘纤维；

含晶细胞壁木化增厚

（1）。

红花花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60μm，具3个萌发孔，外壁有齿状突起

（2）。

结果见图1。

图1 

黄柏、红花显微鉴别

2.2薄层色谱鉴别【1】

2.2.1 

赤芍薄层色谱鉴别

取本品10g，加甲醇50ml，超声20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100-200目,5g,内径1cm）上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含赤芍的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（（2015版药典通则0502））试验【2】，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。

结果见图2。

图2赤芍薄层色谱图

2.2.2 

王不留行薄层色谱鉴别

取本品10g，研细，加70％甲醇25ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至约10ml，作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含王不留行的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取王不留行对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水（4∶6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。

结果见图3。

图3王不留行薄层色谱图

2.2.3 

醋延胡索薄层色谱鉴别

取本品10g，研细，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含醋延胡索的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

结果见图4。

图4醋延胡索薄层色谱图

2.2.4 

黄柏薄层色谱鉴别

取本品10g，研细，加浓氨试液2ml，甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml作为供试品溶液。

另取按处方比例和工艺制备不含黄柏的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。

再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验【3】，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－浓氨试液（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。

结果见图5。

图5黄柏薄层色谱图

2.3 

赤芍中芍药苷的HPLC法含量测定

2.3.1 

色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：

岛津InertsilODS-SPC185um，150×

4.6mm；

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：

乙腈-0.1％磷酸溶液（14：

86）；

流速：

1.0ml/min；

检测波长：

230nm；

柱温：

30℃；

进样量：

10ul；

在此色谱条件下，供试品中芍药苷色谱峰的峰型较好，与其他组分峰能达到基线分离，芍药苷保留时间为10.475min。

理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。

2.3.2 

溶液制备

供试品溶液制备：

取本品适量，研细，约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液制备：

取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含136.9651ug的溶液，即得。

阴性对照品溶液制备：

按照桂芍散结丸的制备工艺，制备不含赤芍的样品，并按“2.3.2”项下“供试品溶液制备”方法制成阴性对照溶液。

2.3.3专属性试验

分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样检测。

供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，阴性对照色谱在与芍药苷对照品色谱相同的保留时间处，无色谱峰干扰。

结果见图6.

A

B

C

图6专属性色谱图

A.芍药苷对照品 

B.供试品 

C.阴性对照

2.3.4线性关系考察

精密称取芍药苷对照品（批号：

11）17.76mg（芍药苷含量96.4%），置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为342.4128ug/ml的对照品溶液，作为贮备液。

从贮备液中分别精密量取2ml、1ml、1ml、2ml、5ml，分别置25ml、10ml、5ml、5ml、10ml的量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为27.3930ug/ml、34.2413ug/ml、68.4826ug/ml、136.9651ug/ml、171.2064ug/ml的对照品溶液。

分别精密吸取上述芍药苷对照品溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。

以芍药苷对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=1445469.47X-35220.60（R=0.9999）。

结果表明，芍药苷进样量在0.2739～3.4241μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 

仪器精密度试验

精密吸取芍药苷对照品溶液（136.9651ug/ml）10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次。

结果，RSD=0.225%（n=6），显示仪器精密度良好。

2.3.6 

稳定性试验

取同一供试品溶液适量（批号：

141212），按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，每隔1小时进样一次，连续考察6小时。

结果，RSD=0.382%（n=6），表明供试品溶液在6小时内稳定。

2.3.7 

重复性试验

取同一批的本制剂（批号：

141212）6份，照“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。

结果，样品平均含量为1.6652mg/g，RSD=0.40%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.8 

加样回收试验

取已测知含量的本制剂适量（批号：

141212，芍药苷含量为1.6652mg/g），研细，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.3.5”项下芍药苷对照品储备液（浓度为342.4128ug/ml）7ml及稀乙醇共计50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

平行制备6份。

分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。

试验结果表明，本方法加样回收率良好。

见表1。

表1加样回收率试验结果（n=6）

取样量

（g）

样品中含量（mg）

对照品加入量（mg）

测得量

（mg）

回收率（%）

平均

（%）

RSD

1.2015

2.0007

2.3969

4.2552

94.06

95.62

1.11

1.2012

2.0002

4.2642

94.46

4.3052

96.16

1.2009

1.9997

4.3058

96.21

1.2005

1.9991

4.3087

96.36

1.2001

1.9984

4.3099

96.44

2.3.9样品含量测定

取3批桂芍散结丸样品（批号141212、141111、141011），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算样品含量，每批测定2次。

结果,3批样品中芍药苷含量分别为1.6639mg/g、1.4216mg/g、1.4188mg/g。

见表2。

表2样品含量测定结果

批号

含量1（mg/g）

含量2（mg/g）

平均含量（mg/g）

141212

1.6636

1.6642

1.6639

141111

1.4229

1.4204

1.4216

141011

1.4193

1.4183

1.4188

3 

讨论

桂芍散结丸所含的药味较多，除本实验已经鉴别的药味外，还进行了其他药味的薄层色谱鉴别研究。

穿山甲在本制剂处方组成中占量较少，薄层色谱鉴别时供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点但不清晰，未列入质量标准。

红花薄层色谱鉴别，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，但是斑点色泽不鲜明，故未作为质量标准。

含量测定试验中对不同取样量（2g、3g、4g）进行了考察，结果分别为1.6554mg/g、1.6632mg/g、1.6713mg/g，显示三种取样量结果差异不大，确定取样量为3g。

对不同提取方法（超声30min、加热回流30min、加热回流1h）进行了比较研究，结果显示芍药苷超声提取30min即可提取完全并且快速、简便、节约能源。

桂芍散结丸是由中药饮片粉碎后的细粉经加工制成的水丸，在1000g的桂芍散结丸中含赤芍生药90g。

根据2015年版一部“赤芍”项下规定，芍药苷的含量限度为“不得少于1.5%”，由此计算理论含量应为1.35mg/g，参考生粉入药其有效成分的转移率为90%这一原则，结合三批样品的含量测定结果，暂定本品每g含赤芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于1.20mg。

参考文献

【1】国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）

【S】.北京：

中国医药科技出版社，2015.

【2】韩德世，鲁建武.祛风消痛颗粒的薄层色谱鉴别【J】.中国医院药学杂志，2007,27（10）：

1472-1473

【3】杨立新，王锦玉.牛黄上清微丸定性及定量分析【J】.中国实验方剂学杂志，2010,16（16）：

69-70

作者简介

杜毅，男，山东淄博人，副主管药师，研究方向：

中药鉴定、中药制剂、中药质量控制。