桂芍散结丸质量标准研究Word格式.docx

1、为了有效控制本制剂质量，保证临床疗效，笔者对方中的红花、黄柏进行了显微鉴别，对王不留行、赤芍、醋延胡索、黄柏药材进行了薄层色谱鉴别，并用高效液相法测定赤芍中芍药苷的含量。1 仪器与试药奥林巴斯BX53型生物显微镜；GOODLOOK-1000薄层色谱成像系统；岛津LC-20A高效液相色谱仪；MS205DU梅特勒电子天平；KS-500EI超声波清洗机；真空脱气器；DP-01无油真空泵。芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，11）；王不留行对照药材（中国食品药品检定研究院，12）；延胡索乙素对照品（中国食品药品检定研究院，11）；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，11）；桂芍散结丸供试品（批

2、号141011、141111、141212）及其相应阴性样品均由淄博市中医医院提供；硅胶G薄层板（Merck公司）；乙腈（天津科密欧，色谱纯）；甲醇（天津康科德，色谱纯）；磷酸（上海安谱科学仪器有限公司，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 显微鉴别取本品粉末，置显微镜下观察：黄柏纤维鲜黄色，直径1638m，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶鞘纤维；含晶细胞壁木化增厚（1）。红花花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60m，具3个萌发孔，外壁有齿状突起（2）。结果见图1。图1 黄柏、红花显微鉴别2.2 薄层色谱鉴别【1】2.2.1 赤芍薄层色谱鉴别取本品10g，加甲醇

3、50ml，超声20分钟，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，加在中性氧化铝柱（100-200目,5g,内径1cm）上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含赤芍的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验【2】，吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶

4、G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（405100.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。结果见图2。图2 赤芍薄层色谱图2.2.2 王不留行薄层色谱鉴别取本品10g，研细，加70甲醇25ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至约10ml，作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含王不留行的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取王不留行对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述

5、三种溶液各2l，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水（46）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点。结果见图3。图3 王不留行薄层色谱图2.2.3 醋延胡索薄层色谱鉴别取本品10g，研细，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次10ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含醋延胡索的阴性对照样品，按上述供试品制备方法制得阴性对照溶液。再取延胡索乙素

6、对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验，吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（92）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见图4。图4 醋延胡索薄层色谱图2.2.4 黄柏薄层色谱鉴别取本品10g，研细，加浓氨试液2ml，甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml作为供试品溶液。另取按处方比例和工艺制备不含黄柏的阴性对照样品，按上述供试品制备方法

7、制得阴性对照溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2015版药典通则0502）试验【3】，吸取上述三种溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯乙酸乙酯异丙醇甲醇浓氨试液（631.51.50.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液色谱在相应位置没有斑点。结果见图5。图5 黄柏薄层色谱图2.3 赤芍中芍药苷的HPLC法含量测定2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：岛津Inertsil ODS-SP C1

8、8 5um，1504.6mm；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-0.1磷酸溶液（14：86）；流速：1.0ml/min；检测波长：230nm；柱温：30；进样量：10ul；在此色谱条件下，供试品中芍药苷色谱峰的峰型较好，与其他组分峰能达到基线分离，芍药苷保留时间为10.475min。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。2.3.2 溶液制备供试品溶液制备： 取本品适量，研细，约3.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照

9、品溶液制备： 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含136.9651 ug的溶液，即得。阴性对照品溶液制备：按照桂芍散结丸的制备工艺，制备不含赤芍的样品，并按“2.3.2”项下“供试品溶液制备”方法制成阴性对照溶液。2.3.3 专属性试验分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样检测。供试品色谱中，在与对照品色谱保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，阴性对照色谱在与芍药苷对照品色谱相同的保留时间处，无色谱峰干扰。结果见图6.ABC图6专属性色谱图A.芍药苷对照品 B. 供试品 C. 阴性对照2.3.4 线性关系考察精密称取芍药苷对照

10、品（批号：11）17.76mg（芍药苷含量96.4%），置50ml容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为342.4128ug/ml的对照品溶液，作为贮备液。从贮备液中分别精密量取2ml、1ml、1ml、2ml、5ml，分别置25ml、10ml、5ml、5ml、10ml的量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为27.3930ug/ml 、34.2413ug/ml、68.4826ug/ml 、136.9651ug/ml、171.2064ug/ml的对照品溶液。分别精密吸取上述芍药苷对照品溶液各10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以芍药苷对照品的进样量为横坐标，峰面积

11、积分值为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=1445469.47X-35220.60（R=0.9999）。结果表明，芍药苷进样量在0.27393.4241g范围内与其峰面积呈良好的线性关系。2.3.5 仪器精密度试验精密吸取芍药苷对照品溶液（136.9651ug/ml）10ul，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次。结果， RSD=0.225%（n=6），显示仪器精密度良好。2.3.6 稳定性试验取同一供试品溶液适量（批号：141212），按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，每隔1小时进样一次，连续考察6小时。结果，RSD=0.382%（n=6），表明供试品溶液在6小时内稳

12、定。2.3.7 重复性试验取同一批的本制剂（批号：141212）6份，照“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。结果，样品平均含量为1.6652 mg/g，RSD=0.40%（n=6），表明方法重复性良好。2.3.8 加样回收试验取已测知含量的本制剂适量（批号：141212，芍药苷含量为1.6652mg/g），研细，取约1.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.3.5”项下芍药苷对照品储备液（浓度为342.4128ug/ml）7ml及稀乙醇共计50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率240W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称

13、定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行制备6份。分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10l，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。试验结果表明，本方法加样回收率良好。见表1。表1 加样回收率试验结果（n=6）取样量（g）样品中含量（mg）对照品加入量（mg）测得量（mg）回收率（%）平均（%）RSD1.20152.00072.39694.255294.0695.621.111.20122.00024.264294.464.305296.161.20091.99974.305896.211.20051.99914.308796.361.20011.998

14、44.309996.442.3.9 样品含量测定取3批桂芍散结丸样品（批号141212、141111、141011），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算样品含量，每批测定2次。结果,3批样品中芍药苷含量分别为1.6639 mg/g、1.4216 mg/g、1.4188 mg/g。见表2。表2样品含量测定结果批号含量1（mg/g）含量2（mg/g）平均含量（mg/g）1412121.66361.66421.66391411111.42291.42041.42161410111.41931.41831.41883 讨论桂芍散结丸所含的药味较多，除本实

15、验已经鉴别的药味外，还进行了其他药味的薄层色谱鉴别研究。穿山甲在本制剂处方组成中占量较少，薄层色谱鉴别时供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点但不清晰，未列入质量标准。红花薄层色谱鉴别，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，但是斑点色泽不鲜明，故未作为质量标准。含量测定试验中对不同取样量（2g、3g、4g）进行了考察，结果分别为1.6554mg/g、1.6632mg/g、1.6713mg/g，显示三种取样量结果差异不大，确定取样量为3g。对不同提取方法（超声30min、加热回流30 min、加热回流1h）进行了比较研究，结果显示芍药苷超声提取30m

16、in即可提取完全并且快速、简便、节约能源。桂芍散结丸是由中药饮片粉碎后的细粉经加工制成的水丸，在1000g的桂芍散结丸中含赤芍生药90g。根据2015年版一部“赤芍”项下规定，芍药苷的含量限度为“不得少于1.5%”，由此计算理论含量应为1.35mg/g，参考生粉入药其有效成分的转移率为90%这一原则，结合三批样品的含量测定结果，暂定本品每g含赤芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于1.20mg。参考文献【1】 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）【S】.北京：中国医药科技出版社，2015.【2】 韩德世，鲁建武.祛风消痛颗粒的薄层色谱鉴别【J】.中国医院药学杂志，2007,27（10）：1472-1473【3】 杨立新，王锦玉.牛黄上清微丸定性及定量分析【J】.中国实验方剂学杂志，2010,16（16）：69-70作者简介杜毅，男，山东淄博人，副主管药师，研究方向：中药鉴定、中药制剂、中药质量控制。