糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究.docx

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糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究

糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

方开云娄晶磊肖瑛石明隽桂华珍郭兵张国忠

【摘要】目的动态观察α平滑肌肌动蛋白（αSMA）和E钙黏素（Ecadherin）在糖尿病（DM）大鼠肾组织中的表达，探讨糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏纤维化逆转的可能性。

方法选择SD大鼠随机分为正常对照组、DM组和胰岛素治疗组，链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠DM。

正常对照组和DM组按病程分为2、4、8、12、16、20和24w组，胰岛素治疗组从第13周起用胰岛素控制血糖至正常水平，分为16、20和24w组。

检测各组血糖、24h尿蛋白、血肌酐（Scr）和肾脏指数（RI）；PAS染色光镜观察肾脏病理改变；免疫组化检测肾皮质αSMA和纤连蛋白（FN）的表达；Western印迹检测肾皮质αSMA和Ecadherin蛋白表达量；RTPCR检测肾皮质αSMA和FNmRNA水平。

结果DM组大鼠血糖、24h尿蛋白、Scr、RI均较正常对照组明显升高（P＜0.05,P＜0.01），胰岛素治疗组上述指标均较DM组显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。

正常大鼠αSMA只在血管壁表达，DM组2w开始有少量间质细胞胞浆内有阳性染色，随病程进展间质细胞阳性染色增多；8w时肾小球系膜细胞胞浆内见阳性表达；从16w开始在DM大鼠肾小管上皮细胞可见αSMA蛋白阳性表达，胰岛素治疗组未见表达；DM组肾皮质αSMA和FN蛋白与mRNA表达水平较正常对照组显著增多（P＜0.01），胰岛素治疗组则显著低于DM组（P＜0.01）；DM组Ecadherin蛋白的表达水平较正常对照组显著降低（P＜0.01），而胰岛素治疗组显著高于DM组（P＜0.01）。

结论控制血糖可使DN大鼠肾脏一定程度的纤维化逆转，其机制可能与肾脏固有细胞表型转变被抑制或反转有关。

【关键词】α平滑肌肌动蛋白；E钙黏素；糖尿病肾病；大鼠

【Abstract】ObjectiveTodynamicobservetheexpressionsofαsmoothmuscleactin（aSMA）andEcadherintoinvestigatethepossibilityofrenalfibrosisreverseindiabeticnephropathyrats.MethodsStreptozotocininduceddiabeticratswererandomlydividedinto2，4，8，12，16，20，24wand16，20，24wtreatmentgroups.Thetreatmentgroupsweretreatedwithinsulintocontrolbloodglucosetonormallevelbeginningfromthe13thweek.Normalcontrolgroupswereselectedinagematchingpointsrespectively.Bloodglucose,24hurineprotein,serumcreatinine（Scr）,renalindex（RI）ofratsweremeasured.PASstainingwasusedtoobservetherenalpathologicalchanges.Immunohistochemicalstaining,WesternblottingandRTPCRwereemployedtodeterminetheexpressionsofαSMA,Ecadherinandfibronectin（FN）.ResultsComparedwithcontrolgroupandinsulintreatedrats,bloodglucose,24hurinaryproteinexcretion,Scr,andRIwereincreasedremarkablyindiabeticrats（P＜0.05,P＜0.01）.Indiabeticrats,interstitial,mesangialcellsandtubulestainingsofαSMAwereseenatthe2,8and16thweekrespectively.TheαSMAandFNproteinandmRNAweresignificantlyupregulatedindiabeticrats,whiledownregulatedintheinsulintreateddiabeticrats（P＜0.01）.TheexpressionofEcadherinproteininthecortexwascontrarytotheexpressionofαSMA.ConclusionsRenalfibrosisatearlystageindiabeticnephropathyratscanbereversedwhenbloodglucosewascontrolledandthemechanismmayinvolveinblockingorreversingthephenotypictransitionofrenalresidentcells.

【Keywords】αSMA;Ecadherin;Diabeticnephropathy;Rat

糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾衰竭的主要病因，肾小管间质纤维化是DN重要的病理改变。

过去认为肾脏纤维化是不可逆转的，近年研究表明，部分肾脏纤维化可以逆转〔1，2〕,但DN肾脏纤维化是否可以逆转及其机制尚需进一步证实。

肾脏纤维化的基本病理改变是细胞外基质（ECM）的过度沉积，进而取代了肾脏固有细胞，破坏肾脏正常结构。

α平滑肌肌动蛋白（αSMA）是成纤维细胞活化和肌成纤维细胞（MFB）的标志性蛋白，因此我们通过动态观察αSMA、E钙黏素（Ecadherin）和纤连蛋白（FN）在糖尿病（DM）发展过程及胰岛素治疗后大鼠肾皮质中的表达，初步探讨DN肾脏纤维化逆转的可能性及其机制。

1材料与方法

1.1动物SD大鼠，清洁级，雄性,体重180～200g，由上海西普尔比凯实验动物有限公司提供〔许可证号：

Scxy（沪）20030002〕。

1.2主要试剂链脲佐菌素（STZ，Sigma），兔抗大鼠Ecadherin、FN多克隆抗体、小鼠抗大鼠αSMA和βactin单克隆抗体、羊抗兔或小鼠IgGHRP（SantaCruz）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、ECM试剂盒（武汉博士德）；EZSpinColumnRNAPurificationKit（BBI），RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit（Fermentas），Taq酶（TaKaRa），αSMA、FN和βactin引物合成（上海生工）。

1.3实验方法

1.3.1动物模型及分组大鼠随机分成正常对照组、DM组和胰岛素治疗组。

正常对照组和DM组又分为2、4、8、12、16、20和24w组（n=6），DM组予以尾静脉注射STZ55mg/kg，72h后测血糖，血糖≥16.7mmol/L者入选。

正常对照组注射同体积的STZ溶媒。

胰岛素治疗组从第13周开始皮下注射精蛋白锌胰岛素，实行个体化剂量，以血糖控制在4～7mmol/L,尿糖阴性为准分为16、20和24w组（n=6）。

所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水。

于处死前1d用代谢笼收集24h尿测尿蛋白；股动脉取血测血糖、血肌酐（Scr）；处死大鼠，取双肾，分别于4%多聚甲醛固定及-80℃保存。

1.3.2生化指标测定氧化酶法测血清葡萄糖,考马斯亮蓝法测尿蛋白,苦味酸法测Scr,均按试剂盒说明书操作（四川迈克科技有限责任公司）。

1.3.3肾组织病理检查多聚甲醛固定之肾组织制成3μm厚的石蜡切片，行PAS染色，光镜观察肾组织形态结构变化。

以肾重（mg）与体重（g）比值作为肾脏指数（RI）。

1.3.4免疫组化石蜡切片脱蜡水化，经微波热修复抗原及5%BSA封闭后，分别加入αSMA（1∶200）和FN抗体（1∶100），4℃孵育过夜。

加入生物素化二抗，室温下孵育30min；滴加SABC试剂；DAB显色。

PBS代替一抗，作阴性对照。

双盲观察染色切片，每张切片随机取10个不重复高倍（400倍）视野,计数细胞的阳性染色，取均值表示αSMA的表达。

FN的表达程度则参考郭兵等〔3〕方法计数，以10个高倍视野的阳性点数取均值。

1.3.5Western印迹取-80℃保存的肾皮质100mg，加裂解液匀浆，离心取上清测定蛋白含量，每泳道加160μg蛋白质，经SDSPAGE垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜。

5%脱脂奶粉室温封闭2h，TBST洗膜后分别加αSMA抗体（1∶400）和Ecadherin（1∶200）4℃孵育过夜；加相应二抗室温孵育2h，ECL试剂曝光显影。

用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与βactin抗体（1∶300）孵育。

凝胶成像系统（ChmioDox,BioRad）和QuantityOne软件进行图像分析。

以βactin蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白/βactin比值表示。

1.3.6RTPCR按EZSpinColumnRNAPurificationKit说明提取总RNA，核酸蛋白分析仪检测含量，RNA的吸光度（A）260nm/280nm比值均在1.9～2.0，逆转录合成cDNA。

PCR的引物序列、退火温度及扩增片段长度见表1。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析。

结果用靶基因/βactin比值表示。

表1PCR引物序列及扩增条件

引物序列片段长度（bp）退火温度（℃）循环数αSMA上游5′CTCTGGTGTGTGACAATGGTCC3′2565840下游5′CGAAGCTCGTTATAGAAGGAGTG3′FN上游5′GCAAGCCTGAACCTGAAGAGACC3′4466240下游5′CCTGGTGTCCTGATCATTGCATC3′βactin上游5′GAAATCGTGCGTGACATTAAG3′49057.340下游5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGA3′

1.4统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS11.5软件，组间比较采用方差齐性检验，作单因素方差分析。

2结果

2.1生化指标测定结果如表2所示DM组各时点的血糖、24h尿蛋白、Scr、RI较正常对照组明显升高（P＜0.05,P＜0.01），胰岛素治疗组上述各指标比相应时点DM组明显下降（P＜0.01），与对照组相比差异无显著性（P＞0.05）。

2.2肾组织病理变化PAS染色（图1）见正常大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整,间质中未见炎症细胞浸润。

DM组大鼠4w后可见肾小球系膜区扩张，肾小管上皮细胞变性,部分肾小管腔内有细胞和管型,管腔扩张,上皮细胞萎缩,间质有较多细胞浸润,肾小管基底膜不规则增厚,肾小管