糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究.docx

1、糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性的研究（作者:_单位: _邮编: _） 作者：方开云 娄晶磊 肖瑛 石明隽 桂华珍 郭兵 张国忠【摘要】 目的 动态观察 平滑肌肌动蛋白（ SMA）和E 钙黏素（E cadherin）在糖尿病（DM）大鼠肾组织中的表达，探讨糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏纤维化逆转的可能性。方法 选择SD大鼠随机分为正常对照组、DM组和胰岛素治疗组，链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠DM。正常对照组和DM组按病程分为2、4、8、12、16、20和24 w组，胰岛素治疗组从第13周起用胰岛素控制血糖至正常水平，分为16、20和24 w组。检测各组血糖

2、、24 h尿蛋白、血肌酐（Scr）和肾脏指数（RI）；PAS染色光镜观察肾脏病理改变；免疫组化检测肾皮质 SMA和纤连蛋白（FN）的表达；Western印迹检测肾皮质 SMA和E cadherin蛋白表达量；RT PCR检测肾皮质 SMA和FN mRNA水平。结果 DM组大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI均较正常对照组明显升高（P0.05,P0.01），胰岛素治疗组上述指标均较DM组显著降低（P0.05,P0.01）。正常大鼠 SMA只在血管壁表达，DM组2 w开始有少量间质细胞胞浆内有阳性染色，随病程进展间质细胞阳性染色增多；8 w时肾小球系膜细胞胞浆内见阳性表达；从16 w开始在DM大

3、鼠肾小管上皮细胞可见 SMA蛋白阳性表达，胰岛素治疗组未见表达；DM组肾皮质 SMA和FN蛋白与mRNA表达水平较正常对照组显著增多（P0.01），胰岛素治疗组则显著低于DM组（P0.01）；DM组E cadherin蛋白的表达水平较正常对照组显著降低（P0.01），而胰岛素治疗组显著高于DM组（P0.01）。结论 控制血糖可使DN大鼠肾脏一定程度的纤维化逆转，其机制可能与肾脏固有细胞表型转变被抑制或反转有关。 【关键词】 平滑肌肌动蛋白；E 钙黏素；糖尿病肾病；大鼠 【Abstract】 Objective To dynamic observe the expressions of smoo

4、th muscle actin (a SMA) and E cadherin to investigate the possibility of renal fibrosis reverse in diabetic nephropathy rats. Methods Streptozotocin induced diabetic rats were randomly divided into 2，4，8，12，16，20，24 w and 16，20，24 w treatment groups.The treatment groups were treated with insulin to

5、control blood glucose to normal level beginning from the 13 th week. Normal control groups were selected in age matching points respectively. Blood glucose, 24 h urine protein, serum creatinine (Scr), renal index（RI）of rats were measured. PAS staining was used to observe the renal pathological chang

6、es. Immunohistochemical staining, Western blotting and RT PCR were employed to determine the expressions of SMA, E cadherin and fibronectin (FN). Results Compared with control group and insulin treated rats, blood glucose, 24 h urinary protein excretion, Scr, and RI were increased remarkably in diab

7、etic rats (P0.05, P0.01). In diabetic rats, interstitial, mesangial cells and tubule stainings of SMA were seen at the 2, 8 and 16 th week respectively. The SMA and FN protein and mRNA were significantly up regulated in diabetic rats, while down regulated in the insulin treated diabetic rats (P0.01)

8、. The expression of E cadherin protein in the cortex was contrary to the expression of SMA. Conclusions Renal fibrosis at early stage in diabetic nephropathy rats can be reversed when blood glucose was controlled and the mechanism may involve in blocking or reversing the phenotypic transition of ren

9、al resident cells. 【Key words】 SMA; E cadherin; Diabetic nephropathy; Rat 糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾衰竭的主要病因，肾小管 间质纤维化是DN重要的病理改变。过去认为肾脏纤维化是不可逆转的，近年研究表明，部分肾脏纤维化可以逆转1，2,但DN肾脏纤维化是否可以逆转及其机制尚需进一步证实。肾脏纤维化的基本病理改变是细胞外基质（ECM）的过度沉积，进而取代了肾脏固有细胞，破坏肾脏正常结构。 平滑肌肌动蛋白( SMA)是成纤维细胞活化和肌成纤维细胞(MFB)的标志性蛋白，因此我们通过动态观察 SMA、E 钙黏素(E cadh

10、erin)和纤连蛋白(FN)在糖尿病（DM）发展过程及胰岛素治疗后大鼠肾皮质中的表达，初步探讨DN肾脏纤维化逆转的可能性及其机制。 1 材料与方法 1.1 动物 SD大鼠，清洁级，雄性,体重180200 g，由上海西普尔 比凯实验动物有限公司提供许可证号：Scxy（沪）2003 0002。 1.2 主要试剂 链脲佐菌素（STZ，Sigma），兔抗大鼠E cadherin、FN多克隆抗体、小鼠抗大鼠 SMA和 actin单克隆抗体、羊抗兔或小鼠IgG HRP（Santa Cruz）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、ECM试剂盒（武汉博士德）；EZ Spin Column RNA Purific

11、ation Kit（BBI），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），Taq酶（TaKaRa）， SMA、FN和 actin引物合成（上海生工）。 1.3 实验方法 1.3.1 动物模型及分组 大鼠随机分成正常对照组、DM组和胰岛素治疗组。正常对照组和DM组又分为2、4、8、12、16、20和24 w组（n=6），DM组予以尾静脉注射STZ 55 mg/kg，72 h后测血糖，血糖16.7 mmol/L者入选。正常对照组注射同体积的STZ溶媒。胰岛素治疗组从第13周开始皮下注射精蛋白锌胰岛素，实行个体化剂量，以血糖控制在47

12、 mmol/L,尿糖阴性为准分为16、20和24 w组(n=6)。所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水。于处死前1 d用代谢笼收集24 h尿测尿蛋白；股动脉取血测血糖、血肌酐(Scr)；处死大鼠，取双肾，分别于4%多聚甲醛固定及-80保存。 1.3.2 生化指标测定 氧化酶法测血清葡萄糖,考马斯亮蓝法测尿蛋白,苦味酸法测Scr,均按试剂盒说明书操作（四川迈克科技有限责任公司）。 1.3.3 肾组织病理检查 多聚甲醛固定之肾组织制成3 m厚的石蜡切片，行PAS染色，光镜观察肾组织形态结构变化。以肾重（mg）与体重（g）比值作为肾脏指数（RI）。 1.3.4 免疫组化 石蜡切片脱蜡水化，经微波热修复抗

13、原及5%BSA封闭后，分别加入 SMA（1200）和FN抗体（1100），4孵育过夜。加入生物素化二抗，室温下孵育30 min；滴加SABC试剂；DAB显色。PBS代替一抗，作阴性对照。双盲观察染色切片，每张切片随机取10个不重复高倍(400倍)视野,计数细胞的阳性染色，取均值表示 SMA的表达。FN的表达程度则参考郭兵等3方法计数，以10个高倍视野的阳性点数取均值。 1.3.5 Western印迹 取-80保存的肾皮质100 mg，加裂解液匀浆，离心取上清测定蛋白含量，每泳道加160 g蛋白质，经SDS PAGE垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜后分

14、别加 SMA抗体（1400）和E cadherin（1200）4孵育过夜；加相应二抗室温孵育2 h，ECL试剂曝光显影。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与 actin抗体（1300）孵育。凝胶成像系统(ChmioDox,Bio Rad)和Quantity One软件进行图像分析。以 actin蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白/ actin比值表示。 1.3.6 RT PCR 按EZ Spin Column RNA Purification Kit说明提取总RNA，核酸蛋白分析仪检测含量，RNA的吸光度（A）260 nm/280 nm比值均在1.92.0，逆转录合成cDNA。PCR的引物序列、

15、退火温度及扩增片段长度见表1。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析。结果用靶基因/ actin比值表示。表1 PCR引物序列及扩增条件 引物序列片段长度(bp)退火温度（）循环数 SMA上游5 CTCTGGTGTGTGACAATGGTCC 32565840下游5 CGAAGCTCGTTATAGAAGGAGTG 3FN上游5 GCAAGCCTGAACCTGAAGAGACC 34466240下游5 CCTGGTGTCCTGATCATTGCATC 3 actin上游5 GAAATCGTGCGTGACATTAAG 349057.340下游5 CTAGAAGCATTTGCGGTGGA

16、 3 1.4 统计学分析 数据以xs表示，采用SPSS11.5软件，组间比较采用方差齐性检验，作单因素方差分析。 2 结 果 2.1 生化指标测定结果 如表2所示DM组各时点的血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI较正常对照组明显升高（P0.05,P0.01），胰岛素治疗组上述各指标比相应时点DM组明显下降（P0.01），与对照组相比差异无显著性(P0.05)。 2.2 肾组织病理变化 PAS染色（图1）见正常大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整,间质中未见炎症细胞浸润。DM组大鼠4 w后可见肾小球系膜区扩张，肾小管上皮细胞变性,部分肾小管腔内有细胞和管型,管腔扩张,上皮细胞萎缩,间质有较多细胞浸润,肾小管基底膜不规则增厚,肾小管