急性毒性毒理.docx

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急性毒性毒理

考察一个药物的急性毒性应该是全面的，它的实验方法有半数致死量、最大耐受量、固定剂量法、近似致死量法、近似半数致死量法；动物选择也可用不同的动物，通常选用2种以上动物；动物数量也可根据试验设计不同而异。

实验一、LD50的测定

[目的]通过实验学习测定药物LD50的方法、步骤和计算过程，了解急性毒性

试验的常规。

[材料]小鼠50只（体重17－25g，雌雄各半）注射器及针头鼠笼普鲁卡因

溶液（本实验以普鲁卡因为试验药物）苦味酸溶液

[方法]根据试验设计要求不同，下列步骤要求略有不同。

探索剂量范围

取小鼠8-10只，以2只为一组分成4-5组，选择组距较大的一系列剂量，分别按组腹腔注射和灌胃普鲁卡因溶液，观察出现的症状并记录死亡数，找出引起0％及100％死亡率（至少应找出引起20％—80％死亡率）剂量的所在范围。

2.进行正式试验

在预初试验所获得的0％和100％致死量范围内，选用几个剂量（一般用5个剂量按等比级数增减）；尽可能使半数组的死亡率都在50％以上，另半数组的死亡率都在50%以下。

各组动物的只数应相等或相差无几，每组10只左右，动物的体重和性别要均匀分配。

完成动物分组和剂量计算后按组腹腔注射给药。

最好先从中剂量组开始，以使能从最初几组动物接受药物后的反应来判断两端的剂量是否合适，否则可随时进行调整。

LD50测定中应观察记录的项目：

实验各要素：

实验题目，实验日期，室温，检品的批号、规格、来源、理化性状、配制方法及所用浓度等；动物品系、来源、性别、体重、给药方式及剂量（药物的绝对量与溶液的容量）和给药时间等。

给药后各种反应；潜伏期（从给药到开始出现毒性反应的时间）；中毒现象及出现的先后顺序，开始出现死亡的时间；死亡集中时间；末只死亡时间；死前现象。

逐日记录各组死亡只数。

尸解及病理切片：

从给药时开始记时，凡两小时以后死亡的动物，均及时尸解以观察内脏的病变，记录病交情况．若有肉限可见变化的则需进行病理检查．整个实验一般要观察7-14天，观察结束时，对全部存活动物称重，尸解，同样观察内脏病变并与中毒死亡鼠尸解情况相比较。

当发现有病变时，也同样作病理检查，以比较中毒后病理改变及恢复情况。

【报告要点】

结果处理

受试剂量（mg/kg）

对数剂量（X）

动物数（只）

死亡动物数（只）

死亡率（%）

概率单位（Y）

LD50及置信限（95%） 

 2、 结果计算

（1）       根据试验设计，采用相应的方法计算LD50，一般采用简化概率法或寇氏改进法，如有计算器程序或计算机软件可使用Blisss计算法。

（2）       计算lgLD50的标准误。

（3）       计算95%可信限（必要时另计算99%可信限）。

（4）       两个LD50值的比较当欲比较同一药物前后两次LD50测定值或两个不同药物的LD50值时，可用两组t检验法进行比较，但计算中不能直接计算LD50的差值，而应用lgLD50的差值，因在LD50计算中是采用对数剂量进行的。

注：

从不同性别动物或以不同途径给药获得的结果应分别列表。

若发现中毒反应和死亡率对不同动物性别有明显差别，则应选用比较敏感的性别进行复试。

急性毒性试验是指一次或24小时内多次染毒的试验，是毒性研究的第一步。

要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。

通常为小鼠或大鼠采用经口、吸入或经皮染毒途径。

急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度），观察急性中毒表现，经皮肤吸收能力以及对皮肤、粘膜和眼有无局部刺激作用等，以提供受试物质的急性毒性资料，确定毒作用方式、中毒反应，并为亚急性和慢性毒性试验的观察指标及剂量分组提供参考。

2概述及染毒方法编辑

一、概念和试验目的

（一）急性毒性概念

急性毒性是指机体（人或实验动物）一次（或24小时内多次）接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。

但须指出化合物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化合物的质与量不同而异。

有的化合物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。

而有的化合物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。

此外，实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。

凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。

而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以“一次”含有时间因素。

（二）实验目的

1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量（通常以LD50为主要参数），以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。

2.阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关系与中毒特征。

3.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化。

也可用于研究急救治疗措施。

二、实验动物和染毒方法

（一）实验动物选择

在卫生毒理学领域中，体内试验以实验动物为研究对象，最终是为了阐明受试外来化合物对人的急性危害性质和危害强度。

所以选择实验动物时，要求在其接触化合物之后的毒性反应，应当与人接触该化合物的毒性反应基本一致，虽然利用任何一种或几种实验动物的急性毒性结果向人外推都必须十分慎重，但这一选择实验动物的原则仍非常重要。

1.物种选择以选择哺乳动物为主。

目前实际应用中以大鼠和小鼠为主，尤以大鼠使用很多。

需指出大鼠并非对外来化合物都最敏丅感。

家兔常用于研究化合物的皮肤毒性，包括对粘膜的刺激。

猫、狗也用于急性毒性试验，但因价贵不易于大量使用。

猪为杂食动物，对一些化合物的生物效应表现与人有相似之处，尤其是皮肤结构与人较近似。

但因体大、价贵，不便大量使用。

归纳起来，在进行化合物急性毒性研究中，选择实验动物的原则是：

尽量选择对化合物毒性反应与人近似的动物；易于饲养管理，试验操作方便；易于获得、品系纯化，且价格较低的动物。

为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。

一般研究外来化合物急性毒性，需雌雄两性动物同时分别进行，每个剂量组两性动物数相等。

急性毒性使用小鼠体重以18~25g、大鼠180~240g、豚鼠200~250g、家兔2~2.5kg、猫1.5~2.0kg左右为宜。

（二）实验动物喂养环境

实验动物喂养室室温应控制在22±3℃，家兔可控制在20±3℃，相对湿度30%～73%，无对流风。

每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度，必要时需单笼饲养。

饲养室采用人工昼夜为好，早6点至晚6点进行12小时光照，其余12小时黑暗，一般食用常规试验室饲料，自由饮水。

（三）实验动物染毒方法

1.经口（胃肠道）接触目的是研究外来化合物能否经胃肠道吸收及求出经口接触的致死剂量（LD50）等。

由于外来化合物可以污染饮水及食物，因此，此种染毒方式在卫生毒理学中占有重要地位。

（1）灌胃是将液态受试化合物或固态、气态化合物溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。

在每一试验系列中，同物种实验动物灌胃体积最好一致，即以单位体重计算所给予的毫升数应一致，即ml/kg或ml/g计。

这是因为成年实验动物的胃容量与体重之间有一定的比例。

按单位体重计算灌胃液的体积，受试化合物的吸收速度相对较为稳定。

小鼠一次灌胃体积在0.2~1.0ml/只或0.1~0.5ml/10g体重较合适，大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只（通常用0.5~1.0ml/100g体重），家兔不超过10ml/2kg体重，狗不超过50ml/10kg体重

试验目的：

急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。

一、啮齿类动物单次给药的毒性试验

（一）试验条件

1．动物品系：

常用健康的小鼠、大鼠。

选用其他动物应说明原因。

年龄一般为7-9周龄。

同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%。

实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。

2．饲养管理：

动物饲料应符合动物的营养标准。

若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。

应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。

3．受试药物：

应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。

（二）试验方法：

由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。

1．伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。

2．最大耐受剂量（MTD）试验方法：

最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。

3．最大受试药物量试验方法：

在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。

4．单次口服固定剂量方法（Fixed-doseprocedure）。

选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。

实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。

如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。

根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。

如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。

每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。

每个剂量试验之间至少应间隔24小时。

给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。

在上述预试的基础上进行正式试验。

每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。

根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。

试验观察：

给受试药物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。

对每只动物均应仔细观察和详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。

给受试药物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。

观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主及中枢神经系统行为表现等。

动物死亡时间的记录要准确。

给受试药物前、给受试药物后1周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。

所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作病理组织学检查。

固定剂量试验法所获得的结果，参考下表标准进行评价。

单次口服固定剂量试验法结果的评价

剂量（mg/kg）

试    验    结    果

存活数<100%

100%存活

毒性表现明显

100%存活

无明显中毒表现

5.0

高毒（Verytoxic）

（LD50≤25mg/kg）

有毒（Toxic）

（LD50＝25-200mg/kg）

用50mg/kg试验

50.0

有毒或高毒

用5mg/kg进行试验

有害（Harmful）

（LD50＝200-2000mg/kg）

用500mg/kg试验

500.0

有毒或有害

用50mg/kg试验

LD50>2000mg/kg

用2000mg/kg试验

2000.0

用500mg/kg试验

该化合物无严重急性中毒的危险性

反复给药的毒性试验（长期毒性试验）

一、目的

观察动物反复给予受试药物后，对机体产生的毒性反应及其严重程度，主要的毒性靶器官及其损害的可逆性，提供无毒性反应剂量及临床上主要的监测指标，为制定人用剂量提供参考。

二、试验条件

（一）动物

1．动物品系：

一般用两种动物，一种啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物。

常用SD或Wister大鼠和Beagle狗或者猴。

选用其他动物，应说明原因。

2．年龄：

根据试验期限的长短而定。

大鼠一般6～9周龄。

Beagleg狗一般6～12月龄。

试验开始时体重差异不应超过或者低于该次试验动物平均体重的20%。

3．实验前至少驯养观察2周。

观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、心电图、有关血液学及血液生化学等功能指标。

选择正常、健康、雌性无孕动物作为受试动物。

（二）饲养管理

1．饲料：

所用饲料应符合动物的营养标准。

若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应提供生产单位。

2．实验的环境条件：

应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。

（三）受试药物：

应写明受试物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。

三、试验方法

（一）试验分组：

一般设三个剂量组和一个对照组。

必要时尚需设溶媒对照组。

低剂量组原则上应高于同种动物药效有效剂量，在此剂量下，动物不出现毒性反应；高剂量组原则上应使动物产生明显的或严重的毒性反应，甚至引起少数动物死亡；为观察毒性反应的剂量关系，在高、低剂量组之间应再设1个中剂量组。

（二）动物数：

每组动物的数量应根据给药周期的长短决定。

大鼠一般为雌、雄各10～30只；Beagle狗或者猴，一般雌、雄各3～4只。

　　（三）给药途径：

原则上应与临床用药途径相同。

若用其他途径应说明原因。

口服给药一般采用灌胃给予受试药物。

如采用将受试药物混入饲料中服用，应提供受试药物与饲料混合的均匀性、受试物的稳定性、有关受试物质量检查及说明动物食入规定受试药物的量等方面的资料，以确保获得准确可靠的试验结果。

临床用药途径为静脉注射时，由于给药周期长，大鼠静注有困难时，可用其它适宜的途径代替。

原则上应每天给药。

试验周期长的试验，也可采取每周给药6天。

每天给药时间应相同。

应根据体重增长情况适时调整给药量。

　　（四）观测项目：

原则上应根据受试物的特点选择其相应的观测指标。

一般共性的观测指标最少应包括以下内容：

　　1．一般观察：

外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状、食量、体重、给药局部反应、狗的心电图变化等。

大鼠群养时，应将出现中毒反应的动物取出单笼饲养。

发现死亡或濒死动物，应及时尸检。

试验期间如动物发生非药物性的疾病反应时，应及时进行隔离处理。

　　2．血液学指标：

红细胞、网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞总数及其分类、血小板。

　　3．血液生化指标：

天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、血糖（GLU）、总胆红素（T-BIL）、肌酐（Crea）、总胆固醇（T-CHO）。

　　4．系统尸解和病理组织学检查：

　　　系统尸解：

应全面细致，为组织病理学检查提供参考。

　　　脏器重量：

一般应称取下列脏器和组织的重量并计算脏器系数：

心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑、前列腺。

　　　病理组织学检查：

对照组和高剂量组动物及尸检异常者应详细检查，其它剂量组在高剂量组有异常时才进行检查。

内容包括：

肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、脑垂体、前列腺、脑、脊髓、心、脾、胸骨（骨和骨髓）、肾、肝脏、肺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸（连附睾）、视神经。

　　（五）恢复性观察：

最后一次给受试药物后24小时，每组活杀部分动物检测各指标，留下部分动物，根据受试物的特点，继续观察一定时间再活杀检查，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。

在此期间除了不给受试物外，其它观察内容与给受试物期间相同。

　　（六）观测指标的时间和次数：

应根据试验期限的长短和受试物的特点而定。

原则上应尽量发现最早出现的毒性反应。

四、说明

（一）关于反复给药毒性试验的期限：

原则上根据临床用药的疗程而定。

1．一般药物的给药期限，可参考下表设计：

表1一般药物反复给药的毒性试验期限

临床疗程（周）

毒性试验期限（月）

啮齿类动物

非啮齿类动物

5天以内

2周

2周

2周以内

1个月

1个月

2～4周

3个月

3个月

4～12周

6个月

6个月

超过12周

6个月

9个月

 2．细胞毒类受试药物，由于细胞毒类受试药物的毒性强弱差别较大，临床上的用药方案也有很大差别，有的一周给药一次，有的两周甚至三周给药一次，因此，很难规范为一种模式。

应根据具体受试药物的特点和反复给药毒性试验的目的设计毒性试验方案。