高效液相分析方法开发2.docx

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高效液相分析方法开发2

有关物质测定hplc方法的建立

液色迷人

一、开始之前必须明白：

1、有关物质来源的两种途径：

1）合成过程中的中间体和副产物；

2）储存过程中产生的降解产物；

2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；

3、样品中可能含有的中间体；

4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；

二、准备工作

1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。

2、没有文献（苦！

），那就很是麻烦了。

1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；

2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；

3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。

4）分析结构。

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5）与同类产品进行比较；

三、开工（以紫外检测为例）

1、流动相的选择（采用粗品进行选择）

1）、有文献，按文献进行优化。

不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。

2）、没有文献。

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a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。

将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。

要是有pda检测器就不需要这一步了。

b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。

2、最低检测限

3、系统适应性试验

重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告

4、考察中间体及副产物和样品的分离度。

同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。

5、考察降解产物和样品的分离情况。

这个一般是通过破坏性试验来考察。

常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。

6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。

现在对三批样品进行测定，通过归一化来观察，应该可以知道杂质的大概情况，根据这个可以定出相应采用自身对照法测定的杂质限量。

一般情况下还应定出最大的单一杂质限量。

如果样品中的杂质可以很好得到纯品，那么你就可以采用外标法来准确定量。

7、杂质的限量必须根据你的样品本身性质来定。

下面是评审中心的一个意见，供参考。

            关于HPLC主成分自身对照法检查有关物质时检测波长确定的讨论

                               审评二部张玉琥

   有关物质检查，包括对产品中残留合成原料、中间体、副产物及可能的降解产物的检查，是控制药品质量的重要指标，目的是检查药品中所含的上述杂质是否符合安全性的要求,同时也是药品稳定性评价中需重点考察的项目。

有关物质检查常用的方法之一是HPLC主成分自身对照法（紫外检测器），即将HPLC色谱图中杂质峰面积与主成分自身对照液峰面积进行比较，以确定杂质限度是否合格。

采用此方法时确定的检测波长是否合理直接影响到方法的可行性，因此检测波长的选择是方法学研究的重要内容。

   在审评中发现一些申报单位在采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质时直接或间接地以主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。

在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有：

   1．直接将主药的最大吸收波长选作检测波长。

   2．简单地套用含量测定的色谱条件。

在HPLC法进行含量测定时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长。

若套用含量测定的色谱条件，实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检测波长。

   3．以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外扫描，将扫描图谱中最大吸收波长确定为有关物质的检测波长。

因破坏性试验后溶液中存在尚未破坏的主药、降解产物、辅料等，此溶液的紫外吸收为各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解产物的紫外吸收特性。

由于未破坏主药所占比例较大，故破坏性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。

   采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质，其前提之一是需检查的杂质与主成分在确定的检测波长下应有相近的紫外吸收（响应值接近），选择检测波长时需对产品中可能存在的杂质（合成原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。

已知杂质的紫外吸收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察，未知杂质（如未知降解产物等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况，根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。

若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。

只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的色谱条件一致。

   另外，HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制。

对于具有明确归属的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。

对于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定，并制定严格的限度。

液色迷人

如何确定被测组分HPLC的检测波长？

答：

该问题非常普遍，一般有以下几种解决方法：

（1）用二极管阵列检测器，这样可以非常方便地确定被测组分最大吸收波长或特征波长。

（2）利用紫外分光光度计进行波长扫描得到被测组分的最大吸收波长或特征波长。

不同溶剂或流动相比例下，得到的组分吸收波长会发生变化，用紫外分光光度计扫描，空白和溶剂应同流动相一致，尤其是极性和离子型化合物。

（3）某些LC有停泵扫描功能，波长范围通常在190～700nm或更高（通常的紫外可见分光光度计的波长范围在190～1100nm），也可以进行类似于波长扫描的操作，以确定目标组分的检测波长。

（4）首先应优先选用被测定组分的最大吸收波长，其次是特征波长，再者是流动相在该波长的吸收不应对被测定组分有干扰。

注意：

用紫外扫描确定样品的吸收光谱，溶解样品的溶剂最好在所选的波长范围内没吸收或吸收强度比较弱。

另外，HPLC测定波长并不一定要选样品的最大吸收波长，有时要选其特征吸收波长。

尤其是在最大吸收和特征吸收不重合时，根据具体情况也可以选特征吸收波长作为检测波长。

此外，如果样品无明显吸收或吸收强度较低，建议取较低波长（如在215nm或更低），一般在此波长下被测组分的吸收相对较强，被检出的组分也较多。

在定量分析中，同时还要考虑样品基质（例如制剂）、样品杂质的影响。

基质和溶剂在所选的波长处应没有吸收，而杂质如没有吸收，肯定影响定量结果的准确度。

跟在老大后面发表一点检测波长选择的个人观点:

          第一种方法，就是选择单一检测波长，也是使用最多的一种方法，这种方法要考虑多方面的因素，首先要考虑药物本身的紫外吸收，其次要考察药物合成中所用到的原料和中间体，另外还要注意药物中所有的各种杂质，包括合成副产物、药物的降解产物等，综合这些所有的因素，选择一个大家吸收系数都差不多的检测波长作为样品的有关物质的检测波长；如果一些杂质的吸收系数与主成分的吸收系数相差比较大的时候，可以加一个校正因子，或者用杂质对照品作为外表法检查杂质。

这种方法应用最为广泛，在目前的药品标准中大约占到90%以上。

      第二种方法，就是用单波长检测同时加参比波长的方法，适用于一些制剂中辅料干扰样品的检测，以及一些其他中药和溶剂对样品检测有干扰的时候，这种方法要求检测单位必须配备二极管阵列检测器，这种方法引用虽然很少，但也是作为波长选择方法的一个很好的补充。

      第三种方法，也就是选用双波长检测，同时选择两个检测波长，每个检测波长下的结果都要达到一定的限度，这种方法也要求检测单位必须配备二极管阵列检测器或者多波长检测器，这种方法适用于复方制剂、以及样品中的杂质与主成分无法找到一个共有的紫外吸收波长。

HPLC谱图异常问题与原因及解决方法

来源:

互联网收集

   液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。

其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。

对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。

a、峰拖尾

  原因        解决方法

1、筛板阻塞  1.a、反冲色谱柱  b、更换进口筛板  c、更换色谱柱

2、色谱柱塌陷  2.填充色谱柱

3、干扰峰        3.a、使用更长的色谱柱  b、改变流动相或更换色谱柱

4、流动相PH选择错误  4.调整PH值。

对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰

5、样品与填料表面的溶化点发生反应  5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱

b、峰前延

    原因            解决方法

1、柱温低              1、升高柱温

2、样品溶剂选择不恰当        2、使用流动相作为样品溶剂

3、样品过载      3、降低样品含量

4、色谱柱损坏      4、见A1、A2

c、峰分叉

原因          解决方法

1、保护柱或分析柱污染    1、取下保护柱再进行分析。

如果必要更换保护柱。

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如果分析柱阻塞，拆下来清洗。

如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。

如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

2、样品溶剂不溶于流动相  2、改变样品溶剂。

如果可能采取流动相作为样品溶剂。

d、峰变形

原因          解决方法

1、样品过载  1、减少样品载量

e、早出的峰变形

原因            解决方法

1、样品溶剂选择不恰当    1、a、减少进样体积  b、运用低极性样品溶剂

f、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

原因      解决方法

1、柱外效应  1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）  b、使用小体积的流通池

g、K’增加时，脱尾更严重

原因            解决方法

1、二级保留效应，反相模式  1、a、加入三乙胺（或碱性样品）  b、加入乙酸（或酸性样品）  c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）  d、更换一支柱子

2、二级保留效应，正相模式  2、a、加入三乙胺（或碱性样品）  b、加入乙酸（或酸性样品）  c、加入水（或多官能团化合物）  d、试用另一种方法

3、二级保留效应，离子对  3、加入三乙胺（或碱性样品）

h、酸性或碱性化合物的峰拖尾

原因          解决方法

1、缓冲不合适  1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液  b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

i、额外的峰

原因          解决方法

1、样品中有其他组份    1、正常

2、前一次进样的洗脱峰    2、a、增加运行时间或梯度斜率  b、提高流速

3、空位或鬼峰    3、a、检查流动相是否纯净  b、使用流动相作为样品溶剂  c、减少进样体积

j、保留时间波动

原因          解决方法

1、温控不当  1、调好柱温

2、流动相组分变化  2、防止变化（蒸发、反应等）

3、色谱柱没有平衡  3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

k、保留时间不断变化

原因        解决方法

1、流速变化  1、重新设定流速

2、泵中有气泡  2、从泵中除去气泡

3、流动相选择不恰当  3、a、更换合适的流动相  b、选择合适的混合流动相

l、基线漂移

原因            解决方法

1、柱温波动。

（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。

通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。

）  1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图

2、流动相不均匀。

（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。

）  2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。

流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

3、流通池被污染或有气体  3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。

如有需要，可以用1N的硝酸。

（不要用盐酸）

4、检测器出口阻塞。

（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）  4、取出阻塞物或更换管子。

参考检测器手册更换流通池窗。

5、流动相配比不当或流速变化  5、更改配比或流速。

为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时  6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成  7、检查流动相的组成。

使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。

  8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

9、使用循环溶剂，但检测器未调整。

  9、重新设定基线。

当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

10、检测器没有设定在最大吸收波长处。

  10、将波长调整至最大吸收波长处

m、基线噪音（规则的）

原因              解决方法

1、在流动相、检测器或泵中有空气  1、流动相脱气。

冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、漏液  2、见第三部分。

检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。

如有必要，更换泵密封。

3、流动相混合不完全  3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂

4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）  4、减少差异或加上热交换器

5、在同一条线上有其他电子设备  5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。

6、泵振动  6、在系统中加入脉冲阻尼器

n、基线噪音（不规则的）

原因          解决方法

1、漏液  1、见第三部分。

检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。

如有必要，更换密封。

检查流通池是否漏液。

2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成  2、检查流动相的组成。

3、流动相各溶剂不相溶  3、选择互溶的流动相

4、检测器/记录仪电子元件的问题  4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。

5、系统内有气泡  5、用强极性溶液清洗系统

6、检测器内有气泡  6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器

7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。

）  7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池

8、检测器灯能量不足  8、更换灯

9、色谱柱填料流失或阻塞  9、更换色谱柱

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常  10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置

o、宽峰

原因          解决方法

1、流动相组成变化  1、重新制备新的流动相

2、流动相流速太低  2、调节流速

3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）  3、见section3。

检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。

如果必要更换密封。

4、检测器设定不正确  4、调整设定

5、柱外效应影响a、  柱子过载b、检测器对反应时间或池体积响应过大c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大d、记录仪响应时间太长  5、  a、  小体积进样（例如：

10ul而不是100ul）以1：

10或1：

100的比例稀释样品b、  减少响应时间或使用更小的流通池c、  使用内径为0.007-0.01的短管路d、  减少响应时间

6、缓冲液浓度太低  6、增加浓度

7、保护柱污染或失效  7、更换保护柱

8、色谱柱污染或失效，塔板数较低  8、更换同样类型的色谱柱。

如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。

9、柱入口塌陷  9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子

10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰  10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果

11、柱温过低  11、提高柱温。

除非特殊情况，温度不宜超过75℃

12、检测器时间常数太大  12、使用较小的时间常数

p、分离度降低

原因                  解决方法

1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）  1、重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞图  2、去掉保护柱进行分析。

如果必要则更换保护柱。

如果分析柱阻塞，可进行反冲。

如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。

如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

q、所有的峰面积都太小

原因          解决方法

1、检测器衰减设定过高    1、减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大  2、设定较小的时间常数

3、进样量太少  3、增大进样量

4、记录仪连接不当  4、使用正确的连接

r、所有的峰面积都太大

原因        解决方法

1、检测器衰减设定过低    1、采取较大的衰减

2、进样过多  2、减少进样量

3、记录仪连接不正确  3、正确连接记录仪