酚氯仿抽提法修改版.docx

酚氯仿抽提法修改版.docx

《酚氯仿抽提法修改版.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酚氯仿抽提法修改版.docx（23页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酚氯仿抽提法修改版

第一篇：

酚氯仿抽提法

求助】PBS-酚/氯仿抽提法提取的DNA方法

大家能介绍一下PBS-酚/氯仿抽提法提取DNA的方法吗,我们实验室没有钱买试剂盒,还

得自己配试剂,谢谢!

!

你是提取细胞的还是血液的？

PBS是洗涤样品的作用吧，我用酚/氯仿抽提法提过DNA，与试剂盒比较起来，总体感觉是浓度大但是纯度不是很纯，但是做PCR的话是能购满足条件得，如果说要做酶切等操作

的话，最好还是用试剂盒抽提以下方法可供你参考，祝你好运

细胞DNA的提取

PBS洗涤离心2次，弃上清，加入400μL裂解液（100mg·L－1蛋白酶K，10mmol·L-1Tris-HCI，15mmol·L-1NaCl，10mmol·L－1EDTA，4g·L－1SDSpH8.0），重悬细胞，37℃保温12～24h。

加450μL平衡酚，混匀，5000g离心10min．转移上层水相，重复酚抽提1次．转移上层水相，加入450μL氯仿：

异戊醇（24：

1），混匀，5000g离心10min。

转移上层水相，加入1／10体积3mol·L－1乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，混匀．置—20℃1h后，IO000g离心15min。

以700mL·L－1乙醇洗涤2次，晾干后，加入50μLTE，－20℃保存备用．

血液提DNA①300ul抗凝全血加1000ulPBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

②去上清液，加1000ulPBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

③去上清液，加500ul消化Buffer（100mg·L－1蛋白酶K，10mmol·L-1Tris-HCI，15mmol·L-1NaCl，10mmol·L－1EDTA，4g·L－1SDSpH8.0），充分混匀，56℃

水浴5h以上。

④加500ul25:

24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

⑤取上清液，加等量的25:

24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

⑥取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀。

（未见沉淀提示

DNA量不多）

⑦15000rpm离心3min。

⑧去上清液，加500ul70%的乙醇，充分混匀，15000rpm离心3min。

⑨去上清液，晾干，加50ulTE完全溶解备用。

我觉得酚/氯仿抽提法提取DNA还是可以的，除了开始做的少数几个标本，我一般提取的纯度没有低于1.8，甚至一些超过了2.0。

不过，我们也不要完全相信仪器的数值，它只能

提供一个参考。

我做的方法是：

1DNA提取（血液）

（1）加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min，弃上清；加400μlSTE，10%SDS40μl，蛋白酶-K10μl（10mg/ml）

（2）56度水如2小时，也可以37度消化过夜；不过后者我做的较少；

（3）等体积饱和酚，倒转摇匀。

12000rpm5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；

小心一点，不要吸入蛋白层；

（4）上清液加等体积的酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1），倒转混匀。

12000rpm5分

钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；

（5）上清液加等体积氯仿：

异戊醇（24：

1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，

取上清入另一管；

（6）加1/12体积3M醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇；然后你会看到白色絮状物（DNA）。

（7）-20℃放置20~30分钟，12000rpm低温（4℃）离心10分钟，沉淀DNA，去上

清；可以直接倒掉；

（8）加1ml70%乙醇洗涤，12000rpm低温（4℃）离心10分钟，去上清，重复1

次；

（9）自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃备用。

我觉得，在提取的时候，吸取上清要根据实际情况，不要有的上清不是很多而偏要定个统一的标准，只要提取的与加入的试剂成一定比例就可以了。

否则，会影响实验结果的。

不过，看到一个战友说“加入酚的液体分层抽吸上层液时，在避免吸入蛋白的前提下，要尽量把上层液吸多点，因为很多DNA就在两层中间；加入醋酸钠和预冷无水乙醇后，放置在－20度冰箱，时间长一点，2小时，以充分沉淀DNA。

”

最好一次不要做得太多，容易出错。

2DNA浓度的测定

取3ulDNA标本加72μl双蒸水，充分混匀后，用紫外分光光度计测定，计算浓度和比值，

判断DNA的浓度和纯度。

若DAN纯度

第二篇：

常规酚-氯仿抽提法改进

常规酚-氯仿抽提法改进.取材：

取50mg肌肉组织放入1.5mLEp管中，加灭菌双蒸水，用灼烧过的剪刀将肌肉剪碎（越碎越好）.

消化：

吸除Eppendorf管中的双蒸水，加入500μL裂解缓冲液及6～7μL的20g/L的蛋白酶K，置于55℃水浴锅中消化.在消化的第1h内，每隔10min混匀1次，加快消化速度.消化时间根据消化程度而定，大约3～4h.

Tris-平衡酚抽提：

4℃、5000r/min条件下，将消化后的组织液离心5min，取上清液至新的Eppendorf管中，加入等体积的Tris-平衡酚（约500μL），旋转器上摇匀10min，在4℃、8000r/min条件下离心15min，上清液移至新的Eppendorf管中.混合抽提：

加入Tris-平衡酚和氯仿异戊醇混合液各250μL，颠倒混匀10min，在4℃、8000r/min条件下离心15min，取上清液至新的Eppendorf管中.

氯仿异戊醇抽提：

加入等体积的氯仿异戊醇，颠倒混匀10min，4℃、8000r/min条件下离心15min.将上层水相小心转移至新的Eppendorf管中.

沉淀：

加入4℃、0.1倍体积浓度为3mol/L的NaAc（约50μL）、2.5倍体积冷冻的无水乙醇（约1mL），旋转混匀.置于-20℃冰箱，沉淀3h以上.

保存：

在4℃、12000r/min条件下离心10min后弃掉溶液，烘干，加入50μL灭菌双蒸水在4℃冰箱保存.

第三篇：

酚氯仿抽提解析大全

DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。

DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。

本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。

二、材料以方法

1、材料：

培养菌体

2、仪器设备：

超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪

3、试剂：

细胞裂解液100mMTris-HCl5mMEDTA500mMNaCl1.25%SDSPH7.5饱和酚，氯仿/异戊醇，酚/氯仿/异戊醇无水乙醇，70％乙醇，异丙醇

3MNaAcpH5.2,RNase，50×TE缓冲液，电泳载样缓冲液

三、操作步骤

（1）培养菌体

（2）加入10ml裂解液，1/10体积酚，于65℃下20－30min，然后加入等体积的氯仿，轻摇（3）12000－15000rpm离心15min（4）取上淸液，加入等体积氯仿，轻摇，12000－15000rpm离心15min（5）取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃）（6）加入1/10体积的3MNaAc（pH5.2），置于室温下10min（7）12000－15000rpm离心10min（8）倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀（9）加入2倍体积无水乙醇（10）12000－15000rpm离心10min（11）倒弃液体留下沉淀，真空干燥（12）复溶于2mlTE（13）加入RNase，65℃或37℃处理10－30min（14）加等体积酚，酚/氯仿，氯仿各一次，12000－15000rpm离心10min（15）取上淸液，加入0.6倍体积冷异丙醇（-20℃）或2倍体积冷无水乙醇（-20℃）（16）加入1/10体积的3MNaAc（PH5.2），置于室温下10min（17）12000－15000rpm离心10min（18）倒弃液体留下沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀（19）真空干燥沉淀

（20）复溶于0.5－1.0ml的TE或水中，分装成小体积，4℃或-20℃保存。

（21）电泳检测提取DNA的质量

四、结果与分析

点样空，若发亮则说明有污染超螺旋结构DNA，若条带有拖尾则说明有破碎的DNA少量未清除的RNA

五、注意事项

1、重点防止DNA的损伤，包括各种物理、化学和机械损伤。

2、干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水，以备后面直接利用。

如果用TE缓冲液溶解，后面还需去离子。

3、取上清时，如果上清液过少，可再加入少量水，重新离心，取上清，避免DNA损失过多。

第四篇：

酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理

酚氯仿法提取DNA主要步骤：

1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。

每个梯度脱水时间为5-10min2.将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液（300μl），研磨后再加入300μlDNA裂解液冲洗研磨棒。

3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h）。

4.加入等体积的Tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。

5.离心：

12000R，7min，4℃。

离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。

6.吸取上层液体加入新的离心管。

7.配制Tris饱和酚：

氯仿：

异戊醇=25:

24:

1。

8.在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl，摇匀10min。

9.离心：

12000R，7min，4℃。

10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl（氯仿：

异戊醇=24:

1）。

11.离心：

12000R，7min，4℃。

12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。

-20℃过夜。

13.将样品取出，12000R，7min，4℃离心。

14.弃上清，留白色沉淀（DNA），加400μl的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。

15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。

16.提取DNA完成。

溴氯仿法提取DNA的原理：

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：

1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNase的降解作用。

缺点：

1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。

2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？

氯仿：

克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：

去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）

用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？

异戊醇：

减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

原理：

动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。

将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。

加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。

加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。

最后用95%乙醇沉淀DNA。

溶解：

将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。

加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。

加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；

除杂质：

加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟，8000r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。

直至界面不出现蛋白凝胶为止；

沉淀：

准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000r/min离心7分钟，得白色沉淀；溶解：

将沉淀物用0.1mol/LNaOH约10毫升溶解,得DNA溶液。

溶液I—溶菌液：

溶菌酶：

它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。

当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：

增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：

（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：

核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：

SDS是离子型表面活性剂。

它主要功能有：

（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

溶液III--3mol／LNaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。

用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。

而高盐的3mol／LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。

前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。

乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。

但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。

折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。

也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一般在室温下放置15－30分钟即可。

在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。

在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？

加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。

也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。

在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。

磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围（pH），可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3（PO4）2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳

苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。

所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。

也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:

1）使用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。

加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊酵为24：

1之比。

也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：

24:

1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：

1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

苯酚：

氯仿：

异戊醇为什么要25:

24:

1？

抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。

而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。

所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。

经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。

也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:

1）使用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。

加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊酵为24：

1之比。

也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：

24:

1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：

1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

第五篇：

苯酚-氯仿法从小鼠尾巴中抽提基因组DNA

从小鼠尾巴中抽提基因组DNA

一、试剂与材料

⑴裂解液：

50mMTris（pH8.0）100mMEDTA0.5%SDS⑵蛋白酶K（ProteinaseK）10mg/ml（溶解在pH8.0,50mMTris和1mMCaCl2中，-20℃保存）。

使用时，终浓度达到100ug/ml

⑶RNaseARNaseA溶液配制

将RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸钠（pH5.2）中，使终浓度为10mg／ml，加热到100℃，15min。

室温下缓慢冷却，用0.1体积的1M的Tris-Cl调整pH至7.4后，小管分装保存在-20℃。

使用时，终浓度为100ug/ml.

⑷Tris平衡苯酚；

氯仿（三氯甲烷）；

Tris平衡苯酚:

氯仿=1:

1（体积比）3M醋酸钠（pH5.2）；

无水乙醇；70%乙醇；

无菌ddH2O.⑸手术剪，1.5mlEP管.

二、方法

⑴剪取0.5cm小鼠尾巴（约20-30mg），立即放入细胞冻存管并投入液氮中（防止基因组DNA降解）。

⑵从液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul蛋白酶K和0.9ulRNaseA，混匀。

⑶在热孵育器中，55℃过夜。

（刚开始可每隔30min摇晃一次）

后续操作可在冰上进行---⑷取出EP管，加入等体积Tris平衡苯酚，用力摇晃3min；12000g，离心10分钟。

⑸轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中（宁可少吸，也不要吸到下层的苯酚或沉淀物）。

⑹向上清中加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃2分钟；12000g，离心2分钟。

⑺吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇，摇匀。

⑻12000g，离心1分钟，尽可能吸除上层乙醇。

⑼加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力摇匀。

（此步为了去除残留的SDS和苯酚）

⑽12000g，离心1分钟，去除乙醇，再重复⑼、⑽一次（为了尽可能把DNA清洗干净）。

⑾将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。

⑿用65℃预热的无菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。

⒀分光光度计检测纯度、浓度。

DNA提取的注意事项

1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。

2、酚一定要碱平衡。

苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会