质粒提取实验方案.docx

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质粒提取实验方案

下面是实验流程和结果：

感受态细胞的制备（CaCl2法）

T-载体连接全过程及转化

挑单克隆

裂碱法提质粒

一．感受态细胞的制备（CaCl2法）

实验前的准备工作：

检查准备无菌的试剂：

0.1MCaCl（应提前预冷）、含10%甘油的0.1MCaCl、无抗生素的LB.1.5ml离心管50ml离心管（6-12个）、200ul与1ml枪尖（各1盒）。

1、挑DH5a单克隆菌落至3ml无抗生素的LB中，37℃摇床培养过夜（在15ml离心管中进行）。

2、1:

20-50扩大培养至250ml培养体系至OD600为0.6-0.8（约3小时）

3、将菌液移入冰水物后开超净台紫外，打开离心机使其预冷，30分钟后分装至50ml离心管中，然后于4℃下5000rpm离心5分钟；

4、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，不能倒掉沉淀）；加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻用枪尖吹动沉淀使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下5000rpm离心5分钟（将两管合并至1管）

5、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液）；加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻用枪尖吹动管底使细胞完全悬浮,4℃下5000rpm离心5分钟；

6、弃去上清，加入15ml预冷含10%甘油的0.1MCaCl，轻轻悬浮细胞，将感受态细胞悬液分装成若干份，每份50μl。

7、用液氮速冻，将感受态细胞置于-80℃保存。

注：

CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！

全过程要再冰上操作，及无菌操作！

二．T-载体连接全过程及转化

第一步：

PCR扩增目的基因及纯化

PCR扩增：

1.PCR反应体系：

在PCR板中进行

无菌水1060ul

Buffer130ul

dNTP20ul

酶25ul

引物120ul

引物220ul

2.PCR反应条件：

PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

95℃5min

95℃45s

40～60℃50s循环35次

72℃55s

72℃10min

3.PCR期间配置琼脂糖凝胶：

PCR结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。

以下为PCR结束以后的跑胶图：

引物10

引物11A

引物11B

引物12A

引物12B

4.PCR产物回收——PCR的纯化

（1）单一PCR产物用氯仿法

●把PCR产物转移至1.5ml的离心管，加500ul无菌水，500ul氯仿异戊醇（24:

1）,混匀后10000rpm离心5-10分钟

●转移上清（约400ul）至灭菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入2倍体积（800µL体积即可）的无水乙醇与NaAc的混合液。

置冰上或-80℃冰箱30分钟以上。

●10000rpm离心10min。

弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，离心3min,于纸上扣干。

小心不要将沉淀洗掉。

●置于恒温器上干燥（55℃）至无色透明或无乙醇气味。

●加入40µL无菌水溶解沉淀备用,在-20摄氏度保存。

第二步：

T-载体连接和转化

1.在微量离心管（PCR管）中配制以下体系：

注：

T-载体试剂盒开封前要向pMD18-TVector管中加入25ul无菌水，同时再管上面做标记。

pMD18-TVector1.0ul

外源DNA1.5ul

SolutionI2.5ul

用封口膜密封PCR管，用低速离心机离心

2.16℃或4℃低温连接1h-2h（最好过夜）；

3.连接产物半量（2.5ul）加入50ul的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后冰上放置30min；DH5α感受态细胞加5ul0.1M的无菌氯化钙做阴性对照；

4.热击：

42℃水浴中热击90秒（注：

精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。

5.复苏：

向每管中加入预冷的400μlLB培养基（注：

不含Amp）,混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。

6.涂布平板筛选转化质粒：

将上述各管培养液摇匀后取100μl分别涂布于含Amp的筛选LB平板上。

（注：

1.将培养液摇匀后涂布，并要把平板涂干。

）正面向上放置15分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养过夜。

7.次日（12-14小时后）观察和从平板上挑取单克隆于甘油LB中（10-20%甘油），每个平板挑3个单克隆，-20℃保存。

三．挑单克隆

选取平板中的单克隆菌落用枪尖挑取两个分别带枪尖打入15ml的离心管中（含3ml带Amp的LB）摇床培养过夜以备提取质粒用。

四．裂碱法提质粒

1.将15ml离心管中的菌液分两组于1.5ml离心管，一组加1.5ml的菌液离心提质粒，另一组加300ul的80%的甘油+1ml的菌液-20摄氏度保存。

2.次日将培养的菌液10000rpm离心3min，弃上清。

3、加入1150µL溶液Ⅰ振荡使菌体沉淀充分悬浮（用枪尖吹起），务必悬浮充分。

4、加入200µL溶液Ⅱ（现用现配），立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。

可观察到原浑浊的菌悬浮液变清变粘，放置时间不能超过3min。

5、加入150µL预冷的溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7-10次，不宜太剧烈。

可观察到白色片状沉淀出现。

6、置冰浴10min，也可置于－20℃中5min。

7、10000rpm离心8-10min。

8、在离心过程中可取未灭菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入等体积（400µL即可）酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）备用，取灭菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入2倍体积（800µL体积即可）的无水乙醇与40ul3MNaAc备用。

9、离心完将上清迅速倒入已加的酚-氯仿-异戊醇中，充分混匀。

小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中。

10、10000rpm离心10min。

11、吸水相，加入已加好的无水乙醇中，颠倒混匀几次（小心不要吸入酚相，没把握时宁可放弃一些水相）。

置冰上或-80℃冰箱30分钟以上。

12、10000rpm离心10min。

13、迅速弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，于纸上扣干。

小心不要将沉淀洗掉。

14、置于恒温器上干燥（55℃）至无色透明或无乙醇气味。

15、加入40µLTE溶解沉淀，琼脂糖电泳检测。

琼脂糖电泳检测结果为：

引物10A组质粒

引物10B组质粒

引物11A组质粒

引物11B组质粒

引物12A组质粒

引物12B组质粒