用Trizol提取DNARNA及蛋白质的方式及注意事项.docx

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用Trizol提取DNARNA及蛋白质的方式及注意事项

TRIZOL试剂

警告：

接触皮肤或误吞将致使中毒或灼伤。

接触皮肤以后当即用去垢剂和水冲洗。

若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。

收到药品后，在室温下存储。

以已证明TRIZOL在常温下可稳固贮存12个月。

说明：

TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。

该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它进展自Chomczynski和Sacchi的RNA一步抽提法。

在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL能够维持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。

离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。

RNA只留在水相中。

转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。

除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也能够用后续沉淀方式回收。

用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。

DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有效。

这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各类量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。

其简单的操作方式允许同时处置大量样品。

整个进程可在1小时内完成。

用TRIZOL提出的总RNA不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern电泳分析、斑点杂交、poly（A）+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议利用一个内含子中的两个引物。

TRIZOL简化了各类类型的大分子及小分子RNA的分离。

例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA的条带，和介于到（tRNA,5S）的小分子RNA的条带。

所分离的RNA稀释于TE时A260/A280之比大于等于。

严防RNase的污染：

在提取中任何不正确的操作方式中都可能偶然引入RNase。

由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。

在处置RNA时需要注意以下规则。

戴一次性手套。

皮肤上往往沾有污染RNA的细菌或霉菌，并成为RNase的来源。

训练良好的微生物学操作方式以避免微生物污染。

利用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。

例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤器背景，而任何不能抛弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的RNaseA。

TRIZOL能够有效避免RnaseA污染。

下游样品的处置需要无RnaseA得玻璃或塑料器皿。

玻璃器皿应该在150℃下烘烤4小时，塑料制品应用的NaOH浸泡10分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。

其他注意事项：

在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管。

用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并实验其可否经受1200gTRIZOL的离心力和氯仿的侵蚀。

不要利用泄露或有裂痕的管子。

离心前小心地称重平衡。

离心前玻璃管需用石蜡膜封锁管口，聚丙烯管必需加盖。

RNA分离技术指南

警告：

利用TRIZOL时必然要戴手套和护目镜。

避免接触皮肤或衣服。

在化学通风橱操作，避免吸入其蒸气。

除特殊情形外，实验操作及试剂存储温度都要求在15-30℃。

需要但无需补充的试剂：

氯仿

异丙醇

75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处置水）

不含RNase水或%SDS溶液（不含RNase水的配制：

将水加入不含Rnase玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至%（v/v），静置留宿，高压灭菌；SDS溶液的配制要用焦碳酸二乙酯处置的无菌水。

）

1．匀浆化

a.组织

每50-100mg组织加入1mlTRIZOL在玻璃管顶用电力匀浆机匀浆化。

取样容积不能超过用于匀浆化的TRIZOL的体积的10%。

b.单层培育细胞

将1mlTRIZOL加入培育皿，用移液枪吹打几回，直接将细胞消化。

TRIZOL的加入量取决于培育皿的体积（每10cm2加1ml），而非细胞数。

若是加入不足会造成提取RNA被DNA污染。

c.悬浮培育细胞

离心沉淀细胞。

在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。

每5-10×106个动物、植物或酵母细胞或每1×107个细菌细胞加1ml消化剂。

在加入TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会增进RNA的降解。

若是需要破碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。

任选：

当处置样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部份等时，还需要添加额外的分离步骤。

均一化结束后，在2-8℃下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部份。

该部份含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。

脂肪组织样品需要将上层多余的脂肪搜集除去。

每次都将清除过得匀浆液转移到新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。

2．相分离

将通过匀浆化处置的样品在15-30℃下孵育5分钟，使核蛋白复合体完全分离。

每1mlTRIZOL加氯仿，小心加盖。

用手猛烈震管子15秒，然后在15-30℃孵育2-3分钟。

在2-8℃下以最高12000g离心力离心15分钟，混合物分为成基层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。

RNA只存在于水相。

水相体积约占均一化TRIZOL试剂体积的60%。

3．RNA沉淀

将水相转到新管，若是需要分离DNA或蛋白质的话保留有机相。

向水相加入异丙醇沉淀RNA，每1mlTRIZOL加异丙醇。

在15-30℃下孵化样品10分钟，在2-8℃下以最高12000g离心力离心10分钟。

通常不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。

4．RNA洗涤

弃去上清。

用75%乙醇洗涤RNA一次，每1ml每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇。

涡旋混合样品，并在在2-8℃下以最高7500g离心力离心5分钟。

5．再溶解RNA

结束时简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。

不要用真空离心的方式干燥RNA。

避免RNA完全干燥超级重要，因为那样会明显降低RNA的溶解性。

部份溶解RNA样品使其A260/280比<。

加入无RNase水或%的SDS溶液，用移液枪吹打几回，在55-60℃下孵育10分钟，溶解沉淀。

（若是RNA要用于酶促反映，就要避免加入SDS。

）RNA也能够溶于100%的甲酰胺（去离子），-70℃保留。

RNA分离注意事项：

1．从少量组织（1-10mg）或细胞（102-104）样品中分离RNA：

向组织或细胞中加入800μlTRIZOL，用相同的方式加入氯仿依照相分离第二步操作。

用异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10μg淀粉作为转入水相的载体。

为降低粘度，在加入氯仿之前现用26计量注射针剪切基因组DNA。

淀粉留在水相与RNA一路沉淀出来。

当浓缩至4mg/ml时淀粉不会抑制单链合成和PCR。

2．匀浆化以后加入氯仿之前，样品能够存于-60到-70℃至少一月。

RNA沉淀（第四步，RNA洗涤）能够保留在75%乙醇2到8℃下至少一周或-5到-20℃下至少一年。

3．若是第二、三步的离心时刻能够达到30-60分钟，最高可达2600的台式离心机也适用于本实验方案。

DNA分离技术指南

如RNA分离实验所述，完全除去水相以后，存在于相界面和酚相的DNA就可以够从原来的匀浆中分离出来。

通过沉淀和一系列的洗涤以后，将DNA溶于8mM的NaOH溶液。

TRIZOL能够回收组织或培育细胞的全DNA，因此它可用于测定待分析样品的DNA含量。

同时抽提基因组DNA，使每一个基因组对应的Northern分析结果归一化成为可能，避免了总RNA或组织重量转变的影响。

（基于不同来源，有的DNA沉淀在利用之前可能还需要进一步的纯化（如酚抽提）。

需要但无需补充的试剂：

乙醇

柠檬酸钠溶于10%乙醇

75%乙醇

8mM的NaOH

1．DNA沉淀

除去留在相界面以上的水相，用乙醇沉淀相界面和有机相中的DNA。

每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加无水乙醇，倒置混匀。

然后在15-30℃下存储2-3分钟，在2-8℃下以最高2000g离心5分钟沉淀DNA。

小心除去水相对分离DNA的品质超级重要。

2．DNA洗涤

除去上层的酚-乙醇，若是需要的话保留以备蛋白分离。

在含柠檬酸钠的10%乙醇中洗涤DNA两次，每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加1ml洗涤溶液。

每次洗涤，都将DNA沉淀在洗液中15-30℃下保留30分钟（周期性混合），并在2-8℃下以最高2000g离心5分钟。

两次离心以后，将DNA沉淀在75%乙醇（每1mlTRIZOL，加%乙醇）15-30℃下保留10-20分钟（周期性混合），并在2-8℃下以2000g离心5分钟。

DNA含量高于200μg的沉淀或大量不含DNA的样品都需要在钠的10%乙醇溶液中再洗涤一次。

3．再溶解DNA

在开放的管中空气干燥DNA5-15分钟。

（不要用离心干燥，因为那将造成溶解困难。

）用8mM的NaOH溶解DNA至终浓度为。

从107细胞或50-70mg组织中分离的DNA需要加300-600μl8mM的NaOH。

建议将DNA重悬于弱碱，因为分离的DNA不易重悬于水或Tris缓冲液。

8mM的NaOH溶液pH约为9，DNA溶解后应该很容易用TE或HEPES调节。

在该阶段，DNA样品（尤其是源于组织的）可能会含有不溶性胶状物质（细胞膜碎片等）。

用12000g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至新管。

溶于8mM的NaOH的DNA能够在4℃保留留宿；若是需要延长贮存时刻，就需要用HEPES调节pH至7-8（见表），并补充1mM的EDTA。

调好pH后，DNA可保留于4℃或-20℃。

DNA的定量和期待产率

取一部份溶于8mM的NaOH的DNA样品溶液，与水混合，测定所得溶液的A260。

用双链DNA的A260值计算其含量，一个A260单位相当于50μg双链DNA/ml。

要计算分析样品的细胞数时，能够假定每一个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA含量别离为：

μg、μg、μg。

应用：

用PCR扩增DNA：

用8mM的NaOH再溶解DNA后，用的HEPES调节pH至（见表）。

加样品到PCR反映混合液，执行标准的PCR反映。

限制性内切反映：

用HEPES调节DNA溶液pH至预定值（见表），也能够选择用1mM，pH7-8的EDTA透析样品。

每微克DNA用3-5单位酶。

个别酶条件依照厂家建议，让反映进行3-24小时。

在典型的测试实验中，80-90%的DNA是可消化的。

DNA样品溶解的8mMNaOH的pH调节：

（1ml8mM的NaOH需用或1MHEPES的量）

FinalpH

MHEPES（μl）

FinalpH

1MHEPES（μl）

86

23

93

32

101

117

159

DNA分离注意事项：

1．酚相和相界面可在2-8℃保留留宿。

2．悬于75%乙醇的样品可在2-8℃保留数月。

3．溶于8mM的NaOH的样品可在2-8℃保留留宿。

需要更长保留时刻的话，要将pH调至7-8，并将EDTA浓度增至1mM。

蛋白质分离技术指南

蛋白质分离自用乙醇沉淀DNA以后的酚-乙醇相（DNA再沉淀第一步）。

所的样品能够用于WB分析特异性蛋白。

需要但无需补充的试剂：

异丙醇

盐酸胍溶于95%乙醇

75%乙醇

1%SDS

1．蛋白质沉淀

用异丙醇从酚-乙醇上清液（每1mlTRIZOL约加）沉淀蛋白质。

每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加异丙醇。

在15-30℃下存储样品10分钟，2-8℃下以12000g离心10分钟沉淀蛋白质。

2．蛋白质洗涤

除去上清，在含盐酸胍的95%乙醇中洗涤蛋白质沉淀3次。

每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加2ml洗液。

每一轮洗涤时，将蛋白质存于15-30℃的洗液20分钟，并在2-8℃下以75000g离心5分钟。

最后一次洗涤完成后。

用2ml乙醇涡旋蛋白质沉淀。

在15-30℃下保留乙醇中的蛋白质沉淀20分钟，并在2-8℃下以75000g离心5分钟。

3．再溶解蛋白质

真空干燥蛋白沉淀5-10分钟。

用移液枪将其溶于1%的SDS。

完全溶解蛋白质沉淀需要在50℃孵育。

在2-8℃下以10000g离心10分钟沉淀所有不容物，将上清移至新管。

所得样品能够用于WB或在-5到-20℃贮存备用。

蛋白质分离注意事项：

1．悬于乙醇或含盐酸胍的95%乙醇的蛋白质沉淀能够在2-8℃下贮存至少1月，在-5到-20℃下贮存至少1年。

2．以下备选方案能够取得更高的回生效率。

在2-8℃下用%SDS透析酚-乙醇上清3次，再以10000g离心10分钟。

澄清的上清液可用于WB。

3．只要SDS浓度低到不会产生影响（＜%），就可以够用Bradford定量蛋白。

也能够用没有去垢剂影响，不依赖于A260/A260的方式（微量的酚会造成蛋白质浓度结果偏高）。

常见问题解决：

RNA分离

1．每mg组织或1×106培育细胞的RNA期望产率

肝、脾，6-10μg

肾，3-4μg

骨骼肌、脑，μg

胎盘，1-4μg

上皮细胞（1×106培育细胞），8-15μg

成纤维细胞，5-7μg

2．低产率

样品匀浆化或消化不完全

RNA沉淀再溶解不完全

3．A260/A280<

分光光度分析前将RNA溶于水而，没有溶于TE

低离子强度和低pH溶液使280nm吸光值升高

样品匀浆化试剂的体积过小

样品匀浆化处置以后，没有在室温下寄存5分钟

水相被酚相污染

最终RNA溶解不足

4．RNA降解

组织从动物体分离后没有当即处置或冷冻

用于分离的样品或分离得的RNA样品保留在-5到-20℃，而不是-70到-70℃

细胞被胰蛋白酶消化了

水溶液或管子含有RNase

在pH以下，将甲醛用于琼脂糖凝胶电泳

5．DNA污染

样品匀浆化试剂的体积过小

用于分离的样品中含有有机溶剂（如乙醇、二甲亚砜）、强缓冲溶液或碱性溶液

6．糖蛋白或多糖污染

以下通过优化的RNA沉淀技术能够从分离RNA中除去这些化合物。

每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL加高盐沉淀液（柠檬酸钠和），然后向水相加入异丙醇。

混合、离心，并按前述方案继续。

该优化方案能够有效地沉淀RNA，而且能够使多糖和糖蛋白维持可溶状态。

从含有大量多糖的植物组织中分离高纯度RNA时，就需要对开始的匀浆液进行改良的离心。

DNA分离

1．每mg组织或1×106培育细胞的DNA期望产率

肝、肾，3-4μg

骨骼肌、脑、胎盘，2-3μg

人、大鼠及小鼠培育细胞（1×106），5-7μg

成纤维细胞，5-7μg

2．低产率

样品匀浆化或消化不完全

DNA沉淀再溶解不完全

3．A260/A280<

分光光度分析前将DNA溶于水而，没有溶于TE

苯酚没有从DNA样品中被充分除去。

用溶于10%乙醇的柠檬酸钠再洗涤DNA沉淀1次。

4．DNA降解

组织从动物体分离后没有当即处置或冷冻

用于分离的样品或分离得的RNA样品保留在-5到-20℃，而不是-70到-70℃

样品在Polytron或其他高速匀浆器中被匀浆化

5．RNA污染

未完全除去水相

DNA沉淀未用溶于10%乙醇的柠檬酸钠有效洗涤。

6．其他应用

用于PCR扩增之前先将pH调至

用限制性内切酶处置DNA时，先将pH调至预定值，每微克DNA用3-5单位酶，个别酶条件依照其最优条件让反映进行3-24小时。

一般80-90%的DNA都是有效的。

蛋白质分离

1．低产率

样品匀浆化或消化不完全

蛋白质沉淀再溶解不完全

3．蛋白质降解

组织从动物体分离后没有当即处置或冷冻

4．聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带畸形

蛋白质沉淀没有充分洗涤

如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。

纯净的样品，比值大于（DNA）或（RNA）。

若是比值低于或，表示存在蛋白质或酚类物质的影响。

A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于。

A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。

纯样品，A320一般是0。