用Trizol提取DNARNA及蛋白质的方式及注意事项.docx

1、用Trizol提取DNARNA及蛋白质的方式及注意事项TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将致使中毒或灼伤。接触皮肤以后当即用去垢剂和水冲洗。若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。收到药品后，在室温下存储。以已证明TRIZOL在常温下可稳固贮存12个月。说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它进展自Chomczynski 和 Sacchi的RNA一步抽提法。在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL能够维持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA

2、。除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也能够用后续沉淀方式回收。用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有效。这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各类量的组织（低至50-100mg，高至1g）和细胞（低至5106，高至107）都有良好的效果。其简单的操作方式允许同时处置大量样品。整个进程可在1小时内完成。用TRIZOL提出的总RNA不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶梯度分离中，建议利用一个内含子中的两个引物。TRIZ

3、OL简化了各类类型的大分子及小分子RNA的分离。例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA的条带，和介于到（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。所分离的RNA稀释于TE时A260/A280之比大于等于。严防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方式中都可能偶然引入RNase。由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。在处置RNA时需要注意以下规则。戴一次性手套。皮肤上往往沾有污染RNA的细菌或霉菌，并成为RNase的来源。训练良好的微生物学操作方

4、式以避免微生物污染。利用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤器背景，而任何不能抛弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的RNaseA。TRIZOL能够有效避免RnaseA污染。下游样品的处置需要无RnaseA得玻璃或塑料器皿。玻璃器皿应该在150下烘烤4小时，塑料制品应用的NaOH浸泡10分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。其他注意事项：在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管。用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并实验其可否经受1200gTRIZOL的离心力和氯仿的侵蚀

5、。不要利用泄露或有裂痕的管子。离心前小心地称重平衡。离心前玻璃管需用石蜡膜封锁管口，聚丙烯管必需加盖。RNA分离技术指南警告：利用TRIZOL时必然要戴手套和护目镜。避免接触皮肤或衣服。在化学通风橱操作，避免吸入其蒸气。除特殊情形外，实验操作及试剂存储温度都要求在15-30。需要但无需补充的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处置水）不含RNase水或%SDS溶液（不含RNase水的配制：将水加入不含Rnase玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至%(v/v)，静置留宿，高压灭菌；SDS溶液的配制要用焦碳酸二乙酯处置的无菌水。）1匀浆化a.组织每50-100mg组织加入1mlTRIZOL在玻璃管顶

6、用电力匀浆机匀浆化。取样容积不能超过用于匀浆化的TRIZOL的体积的10%。b.单层培育细胞将1mlTRIZOL加入培育皿，用移液枪吹打几回，直接将细胞消化。TRIZOL的加入量取决于培育皿的体积（每10cm2加1ml），而非细胞数。若是加入不足会造成提取RNA被DNA污染。c.悬浮培育细胞离心沉淀细胞。在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。每5-10106个动物、植物或酵母细胞或每1107个细菌细胞加1ml消化剂。在加入TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会增进RNA的降解。若是需要破碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。任选：当处置样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材料如肌肉、脂肪组织

7、、植物的块茎部份等时，还需要添加额外的分离步骤。均一化结束后，在2-8下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部份。该部份含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组织样品需要将上层多余的脂肪搜集除去。每次都将清除过得匀浆液转移到新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。2相分离 将通过匀浆化处置的样品在15-30下孵育5分钟，使核蛋白复合体完全分离。每1mlTRIZOL加氯仿，小心加盖。用手猛烈震管子15秒，然后在15-30孵育2-3分钟。在2-8下以最高12000g离心力离心15分钟，混合物分为成基层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。RNA只存在于水相。水相体积约占

8、均一化TRIZOL试剂体积的60%。3RNA沉淀 将水相转到新管，若是需要分离DNA或蛋白质的话保留有机相。向水相加入异丙醇沉淀RNA，每1mlTRIZOL加异丙醇。在15-30下孵化样品10分钟，在2-8下以最高12000g离心力离心10分钟。通常不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。4RNA洗涤 弃去上清。用75%乙醇洗涤RNA一次，每1ml每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇。涡旋混合样品，并在在2-8下以最高7500g离心力离心5分钟。5再溶解RNA 结束时简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。不要用真空离心的方式干燥RNA。避免RNA完全干燥超级重要，因为那样会

9、明显降低RNA的溶解性。部份溶解RNA样品使其A260/280比 。加入无RNase水或%的SDS溶液，用移液枪吹打几回，在55-60下孵育10分钟，溶解沉淀。（若是RNA要用于酶促反映，就要避免加入SDS。）RNA也能够溶于100%的甲酰胺（去离子），-70保留。RNA分离注意事项：1从少量组织（1-10mg）或细胞(102-104)样品中分离RNA：向组织或细胞中加入800lTRIZOL，用相同的方式加入氯仿依照相分离第二步操作。用异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10g淀粉作为转入水相的载体。为降低粘度，在加入氯仿之前现用26计量注射针剪切基因组DNA。淀粉留在水相与RNA一路沉淀出来。当

10、浓缩至4mg/ml时淀粉不会抑制单链合成和PCR。2匀浆化以后加入氯仿之前，样品能够存于-60到-70至少一月。RNA沉淀（第四步，RNA洗涤）能够保留在75%乙醇2到8下至少一周或-5到-20下至少一年。3若是第二、三步的离心时刻能够达到30-60分钟，最高可达2600的台式离心机也适用于本实验方案。DNA分离技术指南如RNA分离实验所述，完全除去水相以后，存在于相界面和酚相的DNA就可以够从原来的匀浆中分离出来。通过沉淀和一系列的洗涤以后，将DNA溶于8mM的NaOH溶液。TRIZOL能够回收组织或培育细胞的全DNA，因此它可用于测定待分析样品的DNA含量。同时抽提基因组DNA，使每一个基

11、因组对应的Northern分析结果归一化成为可能，避免了总RNA或组织重量转变的影响。（基于不同来源，有的DNA沉淀在利用之前可能还需要进一步的纯化（如酚抽提）。需要但无需补充的试剂：乙醇柠檬酸钠溶于10%乙醇75%乙醇8mM的NaOH1DNA沉淀除去留在相界面以上的水相，用乙醇沉淀相界面和有机相中的DNA。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加无水乙醇，倒置混匀。然后在15-30下存储2-3分钟，在2-8下以最高2000g离心5分钟沉淀DNA。小心除去水相对分离DNA的品质超级重要。2DNA洗涤 除去上层的酚-乙醇，若是需要的话保留以备蛋白分离。在含柠檬酸钠的10%乙醇中洗涤DNA两次，

12、每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加1ml洗涤溶液。每次洗涤，都将DNA沉淀在洗液中15-30下保留30分钟（周期性混合），并在2-8下以最高2000g离心5分钟。两次离心以后，将DNA沉淀在75%乙醇（每1ml TRIZOL，加%乙醇）15-30下保留10-20分钟（周期性混合），并在2-8下以2000g离心5分钟。DNA含量高于200g的沉淀或大量不含DNA的样品都需要在钠的10%乙醇溶液中再洗涤一次。 3再溶解DNA 在开放的管中空气干燥DNA5-15分钟。（不要用离心干燥，因为那将造成溶解困难。）用8mM的NaOH溶解DNA至终浓度为。从107细胞或50-70mg组织中分离的DN

13、A需要加300-600l8mM的NaOH。建议将DNA重悬于弱碱，因为分离的DNA不易重悬于水或Tris缓冲液。8mM的NaOH溶液pH约为9，DNA溶解后应该很容易用TE或HEPES调节。在该阶段，DNA样品（尤其是源于组织的）可能会含有不溶性胶状物质（细胞膜碎片等）。用12000g离心10分钟除去不溶物，将含DNA的上清移至新管。溶于8mM的NaOH的DNA能够在4保留留宿；若是需要延长贮存时刻，就需要用HEPES调节pH至7-8（见表），并补充1mM的EDTA。调好pH后，DNA可保留于4或-20。DNA的定量和期待产率取一部份溶于8mM的NaOH的DNA样品溶液，与水混合，测定所得溶液

14、的A260。用双链DNA的A260值计算其含量，一个A260单位相当于50g双链DNA/ml。要计算分析样品的细胞数时，能够假定每一个人、大鼠、小鼠的二倍体细胞的DNA含量别离为：g、g、g。应用：用PCR扩增DNA：用8mM的NaOH再溶解DNA后，用的HEPES调节pH至（见表）。加样品到PCR反映混合液，执行标准的PCR反映。限制性内切反映：用HEPES调节DNA溶液pH至预定值（见表），也能够选择用1mM，pH7-8的EDTA透析样品。每微克DNA用3-5单位酶。个别酶条件依照厂家建议，让反映进行3-24小时。在典型的测试实验中，80-90%的DNA是可消化的。DNA样品溶解的8mM

15、NaOH的pH调节：（1ml8mM的NaOH需用或1MHEPES的量）Final pH M HEPES (l)Final pH1 M HEPES (l)86239332101117159DNA分离注意事项：1酚相和相界面可在2-8保留留宿。2悬于75%乙醇的样品可在2-8保留数月。3溶于8mM的NaOH的样品可在2-8保留留宿。需要更长保留时刻的话，要将pH调至7-8，并将EDTA浓度增至1mM。蛋白质分离技术指南蛋白质分离自用乙醇沉淀DNA以后的酚-乙醇相（DNA再沉淀第一步）。所的样品能够用于WB分析特异性蛋白。需要但无需补充的试剂：异丙醇盐酸胍溶于95%乙醇75%乙醇1%SDS1蛋白质沉

16、淀用异丙醇从酚-乙醇上清液（每1mlTRIZOL约加）沉淀蛋白质。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加异丙醇。在15-30下存储样品10分钟，2-8下以12000g离心10分钟沉淀蛋白质。2蛋白质洗涤 除去上清，在含盐酸胍的95%乙醇中洗涤蛋白质沉淀3次。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL，加2ml洗液。每一轮洗涤时，将蛋白质存于15-30的洗液20分钟，并在2-8下以75000g离心5分钟。最后一次洗涤完成后。用2ml乙醇涡旋蛋白质沉淀。在15-30下保留乙醇中的蛋白质沉淀20分钟，并在2-8下以75000g离心5分钟。3再溶解蛋白质 真空干燥蛋白沉淀5-10分钟。用移液枪将其溶于

17、1%的SDS。完全溶解蛋白质沉淀需要在50孵育。在2-8下以10000g离心10分钟沉淀所有不容物，将上清移至新管。所得样品能够用于WB或在-5到-20贮存备用。蛋白质分离注意事项：1悬于乙醇或含盐酸胍的95%乙醇的蛋白质沉淀能够在2-8下贮存至少1月，在-5到-20下贮存至少1年。2以下备选方案能够取得更高的回生效率。在2-8下用%SDS透析酚-乙醇上清3次，再以10000g离心10分钟。澄清的上清液可用于WB。3只要SDS浓度低到不会产生影响（%），就可以够用Bradford定量蛋白。也能够用没有去垢剂影响，不依赖于A260/ A260的方式（微量的酚会造成蛋白质浓度结果偏高）。常见问题解

18、决：RNA分离1每mg组织或1106培育细胞的RNA期望产率 肝、脾，6-10g 肾，3-4g骨骼肌、脑，g 胎盘，1-4g上皮细胞（1106培育细胞），8-15g 成纤维细胞，5-7g2低产率 样品匀浆化或消化不完全 RNA沉淀再溶解不完全3A260/A280 分光光度分析前将RNA溶于水而，没有溶于TE 低离子强度和低pH溶液使280nm吸光值升高 样品匀浆化试剂的体积过小 样品匀浆化处置以后，没有在室温下寄存5分钟 水相被酚相污染 最终RNA溶解不足4RNA降解 组织从动物体分离后没有当即处置或冷冻 用于分离的样品或分离得的RNA样品保留在-5到-20，而不是-70到-70 细胞被胰蛋白

19、酶消化了 水溶液或管子含有RNase 在pH以下，将甲醛用于琼脂糖凝胶电泳5DNA污染 样品匀浆化试剂的体积过小 用于分离的样品中含有有机溶剂（如乙醇、二甲亚砜）、强缓冲溶液或碱性溶液6糖蛋白或多糖污染 以下通过优化的RNA沉淀技术能够从分离RNA中除去这些化合物。每1ml开始匀浆化时加入的TRIZOL加高盐沉淀液（柠檬酸钠和），然后向水相加入异丙醇。混合、离心，并按前述方案继续。该优化方案能够有效地沉淀RNA，而且能够使多糖和糖蛋白维持可溶状态。从含有大量多糖的植物组织中分离高纯度RNA时，就需要对开始的匀浆液进行改良的离心。DNA分离1每mg组织或1106培育细胞的DNA期望产率 肝、肾，

20、3-4g骨骼肌、脑、胎盘，2-3g人、大鼠及小鼠培育细胞（1106），5-7g 成纤维细胞，5-7g2低产率 样品匀浆化或消化不完全 DNA沉淀再溶解不完全3A260/A280 分光光度分析前将DNA溶于水而，没有溶于TE 苯酚没有从DNA样品中被充分除去。用溶于10%乙醇的柠檬酸钠再洗涤DNA沉淀1次。4DNA降解 组织从动物体分离后没有当即处置或冷冻 用于分离的样品或分离得的RNA样品保留在-5到-20，而不是-70到-70 样品在Polytron或其他高速匀浆器中被匀浆化5RNA污染 未完全除去水相DNA沉淀未用溶于10%乙醇的柠檬酸钠有效洗涤。6其他应用 用于PCR扩增之前先将pH调至

21、 用限制性内切酶处置DNA时，先将pH调至预定值，每微克DNA用3-5单位酶，个别酶条件依照其最优条件让反映进行3-24小时。一般80-90%的DNA都是有效的。蛋白质分离1低产率 样品匀浆化或消化不完全 蛋白质沉淀再溶解不完全3蛋白质降解 组织从动物体分离后没有当即处置或冷冻4聚丙烯酰胺凝胶电泳中条带畸形 蛋白质沉淀没有充分洗涤如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于（DNA）或（RNA）。若是比值低于 或，表示存在蛋白质或酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。