化学发光分析法测定黑米色素抗氧化作用精.docx
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化学发光分析法测定黑米色素抗氧化作用精
化学发光分析法测定黑米色素抗氧化作用
龙盛京
（广西医科大学化学教研室,南宁530021
摘 要:
运用化学发光分析法研究了黑米色素抗活性氧能力大小,测定了黑米色素对全血化学发光的抑制和清除O-2、・OH、H2O2的作用。
结果表明,黑米色素对全血化学发光有较大的抑制作用,即对由细胞体系产生的活性氧有较大的消除作用;对非细胞体系产生的活性氧化也有一定的消除能力。
关键词:
化学发光分析;黑米;色素;抗氧化作用;活性氧
中图分类号:
O65 文献标识码:
A 文章编号:
100020720（199********04
机体在生理过程或应激过程可产生超氧阴离子自由基（O-2、过氧化氢（H2O2和羟基自由基（・OH等活性氧物质,而过量产生的活性氧则可造成组织细胞损伤,引起细胞死亡或细胞凋亡[1]。
经过多年研究已经证明自由基与一百多种人类疾病有关。
本实验用化学发光分析方法来评价黑米色素抗活性氧的能力,旨为黑米的科学应用提供实验依据。
1 试剂、仪器、样品及色素的提取
缓冲溶液为无酚红的pH7.4的Hanks平衡盐溶液（HBSS。
酵母多糖（sigma产品称取30mg酵母多糖悬于3mL生理盐水中,水浴煮沸30min后离心,弃去上清液,沉淀再悬于HBSS缓冲溶液中,终质量浓度为5gL,4℃保存。
鲁米诺（Merck2Schuchrat产品称819mg鲁米诺,加入0120mL二甲基亚砜溶解后,加pH7.4的Hanks应用液50mL,电磁搅拌5h。
终浓度为1mmolL,冰箱保存。
DG3030发光光度计（南京华东电子管厂。
黑米（紫香米由广东省农科院提供。
黑米色素的提取:
400g黑米加入70%乙醇1200mL,室温浸泡,24h后过滤。
滤渣加70%乙醇再浸泡24h,过滤。
合并二次滤液,减压浓缩,得黑米粗色素提取物。
黑米粗色素提取物硅胶柱层析,先用氯仿:
95%乙醇=2∶8洗脱液洗脱,得黑米色素A收集液;然后改用75%乙醇洗脱,得黑米色素B收集液。
黑米色素A、B两收集液经减压浓缩,真空干燥得黑米色素A和黑米色素B。
A、B两样品经定性分析与文献[2]相似,为黄酮花色苷类化合物。
2 实验方法
211 样品对全血化学发光抑制作用的测定在文献[3]的基础上改进 选用Wistar大鼠,后双脚注射3%甲醛011mL。
12h后双脚水肿,眼部取血,肝素抗凝。
然后立即按血液∶HBSS液
收稿日期:
1998209211
资金来源:
国家自然科学基金资助项目,No.39060028;广西教育厅科研项目,No.9733作者简介:
龙盛京（1957-,男,副教授
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=1∶8比例稀释,混匀,4℃冰箱保存备用。
用时取019mL稀释血,加入不同量的供试液（空白不加,然后加入鲁米诺50ΛL,37℃恒温水浴箱中衡温10min后,加入酵母多糖100ΛL,记时,混匀。
置于37℃恒温水浴箱中保温到10min时测定发光强度。
每次延时Os,测定60s,积分60s,仪器放大倍数1×103。
完成后仪器自动打印出发光强度积分值。
212 样品清除羟基自由基（・OH的测定方法参考文献[4]的方法略加改进 原用50mmolL磷酸钠缓冲液配制的试剂都改由二次蒸馏水配。
所用试剂和样品均放在37℃恒温水浴箱中保温,在测定管中加入浓度为118mmolL的维生素012mL,浓度为118mmolL的硫酸铜014mL,质量浓度为500gL的酵母012mL,浓度为0.2molLpH6.2的磷酸钠缓冲溶液016mL,混匀,加入不同量的供试液（空白不加,混匀,置于发光仪中,于37℃加入浓度为60mmolL的双氧水016mL,启动反应后,测定10s内发光强度的总值。
样品清除过氧化氢的测定方法参照文献[5]的方法。
样品清除超氧阴离子自由基的测定方法按文献[6]的方法。
3 结果与讨论
样品的抗氧化作用大小用清除率或抑制率以及抗氧化值表示。
每种方法每个样品平行做3次,取平均值,按下式计算清除率或抑制率:
清除率或抑制率（%=（（空白值-样品值空白值×100%
液体CI50、固体CI50、抗氧化值的计算:
液体CI50和固体CI50为从量效关系曲线回归方程推出的,当清除率为50%时所需的样品毫升数或样品毫克数。
抗氧化值（AOV=（S测-S标S标
S测=固体CI50（mg,S标=维生素C固体CI50或硫脲固体CI50。
以维生素C为标准的抗氧化值（或以硫脲为标准的抗氧化值规定维生素C的AOV为零。
当AOV为负值时,该样品抗氧化能力就比维生素C强,如AOV为正值,,则抗氧化能力就越弱。
311 黑米色素对全血化学发光的抑制作用由表1可见,黑米色素A、B两样品对全血化学发光有较强的抑制作用并呈量效关系。
从AOV的数据比较,两样品抑制全血化学发光的作用与维生素C相当。
揭示它们对细胞体系产生的活性氧有较强的清除作用。
312 黑米色素对过氧化氢的清除作用
黑米色素A、B两样品对过氧化氢都有较强的清除作用,其中黑米色素B的AOV为负数,表明黑米色素B清除过氧化氢的能力比维生素C强,结果见表2。
表1 黑米色素对全血发光的抑制作用
Table1 Inhibitoryeffectsofthepigmentfromblackriceonchemiluminescenceinwholeblood
样品浓度
（gL
抑制率（%（X±SD
10ΛL
50ΛL
（用量
100ΛL
CI50
原液
（ΛL
固体
（mg
AOV
黑米色素A515173±518558180±417369137±115340*********010977
黑米色素B530109±319758188±019292181±111838112011906010431
维生素C518141±512153125±217678198±1138361540118270100
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表2 黑米色素对过氧化氢的清除作用
Table2 PercentagesofH2O2scavengedbythepigmentfromblackrice
样品浓度
（gL
清除率（%（X±SD
1ΛL
5ΛL
（用量
10ΛL
CI50
原液
（ΛL
固体
（mg
AOV
黑米色素A533161±211957110±111979199±21963198801019940186141黑米色素B550180±319472163±118287121±11750199320100496-015364
1ΛL3ΛL5ΛL
维生素C514125±114962124±118194107±012821142301010701000
313 黑米色素对超氧阴离子自由基（O-2的清除作用
黑米色素对O-2都有一定的清除能力,但是两黑米色素清除O-2的AOV数据都大于30,这表明对O-2的清除能力比维生素C要小30倍左右,结果见表3。
314 黑米色素清除羟基自由基的作用
由表4可见,黑米色素A、B两样品对・OH有一定的清除作用,其中黑米色素B的清除能力强于黑米色素A,但两者对・OH的清除作用都小于硫脲。
表3 黑米色素清除超氧阴离子自由基的作用
Table3 PercentagesofO-2scavengedbythepigmentfromblackrice
样品浓度
（gL
清除率（%（X±SD
10ΛL
50ΛL
（用量
100ΛL200ΛL
CI50
原液
（ΛL
固体
（mg
AOV
黑米色素A520186±116438138±314774103±111610714501537234121
黑米色素B5
1ΛL28125±3147
3ΛL
51189±0170
5ΛL
74190±11719511301475630117
维生素C514183±312251139±112881118±01243105010150100
表4 黑米色素清除超羟基自由基的作用
Table4 Percentagesof・OHbyscavengedbythepigmentfromblackrice
样品浓度
（gL
清除率（%（X±SD
500ΛL1000ΛL
（用量
1500ΛL
CI50
原液
（ΛL
固体
（mg
AOV
黑米色素A530109±510049110±115164176±3129105812351291121581
黑米色素B549106±3142
10ΛL65120±4132
50ΛL
77117±1103
100ΛL
526178216345176
硫脲513122±419940181±313555133±112757719201390100
全血中的白细胞受到酵母多糖的刺激后,产生免疫反应,通过已糖磷酸支路代谢途径的—
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活化,发生呼吸暴发,产生活性氧,并伴随发光现象。
但这种发光现象非常弱,需要高灵敏度的仪器才能检测到。
如果在细胞吞噬的过程中加入冷光剂鲁米诺,则发光强度明显增强,这是由于细胞吞噬过程中所产生的活性氧把鲁米诺氧化成激发态分子,被激发的鲁米诺退激回基态时产生波长为425nm的化学发光。
Allen和Kato在此基础上先后建立了以全血为材料检测呈噬细胞化学发光的方法。
其结果表明,全血化学发光与细胞吞噬氧化功能成正比,与吞噬过程产生的活性氧浓度成正比[7,8]。
在全血化学发光体系中加入的样品如能消除活性氧,则全血化学发光强度就会减弱,由此可根据样品抑制全血化学发光的强弱来衡量其清除由细胞体系产生的活性氧能力的大小。
黑米色素对全血化学发光的抑制作用较大,这揭示黑米色素对细胞体系产生的活性氧有较大的清除能力。
黑米色素为黄酮花色苷类化合物,其分子结构中有酚羟基存在,黑色素对细胞体系或非细胞体系产生的活性氧都有一定的清除作用,这与酚羟基的存在有关。
酚羟基是一类较为活泼的官能团之一,易被活性氧氧化,而表现出较强的抗活性氧化的能力。
结果提示,黑米的食疗功能与黑米色素的抗活性氧能力有关,黑米色素是食品中较好的自由基清除剂之一。
黑米色素在体内代谢过程中的抗氧化作用如何有待进一步研究。
参考文献
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76~79
Theinhibitoryeffectofpigmentfromblackriceonactiveoxygenwasstudiedbyusingchemiluminescence.Theinhibitiononcheminescenceinwholebloodandthescavengingeffectsonperoxideanionradicals,hydroxylradicalandhydrogenperoxideweremeasured.Theresultsshowedthatthepigmentfromblackricemarkdlyinhibitchemiluminescenceinwholeblood,andscavengetheactiveoxygenproducedbynon2cellularsystemstoacertainextent.Theseresultssuggestthattheblackricehasthefuncetionofdietetictherapy,andthepigmentfromblackriceisoneofthebetterfreeradicalscavengersinblackfood.
Keywords Blackrice;pigment;chemiluminescenceantioxidation;activeoxygen
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