Q TRAP系统的LIT扫描模式.docx

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QTRAP系统的LIT扫描模式

QTRAPTM系统的LIT扫描模式

本指南包括线性离子阱（LIT）的各种扫描模式。

该方法采用TurboIonSpray离子源，正离子模式检测，用注射泵直接进样。

GluFibrinopeptideB标准溶液的配制参见附录。

增强型全扫描（EMS）

EMS是一种标准的离子阱扫描方式。

离子源产生的离子通过四极杆（RFohly），进入离子阱。

离子阱充满后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。

增强多电荷扫描（EMC）

EMC是一种标准的离子阱扫描方式，可用来提高多电荷离子的信噪比。

离子源产生的离子通过四极杆（RFohly），进入离子阱。

离子阱充满后，单电荷离子从离子阱中排空，主要留下多电荷离子。

然后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。

增强分辨率扫描（ER）

这种扫描方式可以获得感兴趣离子的高分辨MS。

第一个质量扫描四极杆（Q1）设定质量窗口为感兴趣离子的左右6-8amu。

离子被贮存在离子阱中，在一个较窄的质量范围（~20amu）内以低扫描速度（250amu/sec）扫描输出。

这种扫描方式可以得到~0.15amuFWHM峰宽。

增强型子离子扫描（EPI）

EPI用于获得特定离子的高品质的MS/MS谱。

在碰撞室中发生裂解，从而提供丰富的MS/MS碰撞诱导裂解信息。

在这种模式下，先在Q1中选择母离子，质量窗口宽度为1-4amu，滤掉其它所有的离子。

母离子在Q2碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。

产生的碎片离子被离子阱捕获；然后根据碎片离子分辨率的要求，以三种扫描速度中的一种扫描输出。

MS/MS/MS扫描

MS/MS/MS扫描可用于获得特定MS/MS离子的进一步的信息，在这种模式下，先在Q1中选择一级母离子，质量窗口宽度为1-4amu，该离子在碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。

产生的碎片离子进入离子阱中，其中一个碎片离子被选择性地分离出来（分离的宽度为1-5amu）。

分离之后，该离子被一个单波长激发频率所激发（激发宽度~1Da）发生裂解（激发能量可以由用户控制）。

产生的碎片离子被离子阱捕获；然后以三种扫描速度中的一种扫描输出。

时间延迟碎裂扫描（TDF）

这种扫描方式可以简化MS/MS谱的低质量区。

TDF扫描之后，低质量区主要为y-离子，因而这种扫描方式是确定多肽denovo序列的有力工具。

在TDF模式下，离子在Q2和Q3之间的低压区域被击活。

由于低压，被击活离子弛豫速率降低。

能量较高的离子（能够产生次级碎片离子，使低质量部分的图谱复杂化）将快速裂解不在离子阱中贮存。

能量较高的碎片离子将贮存在离子阱中，在TDF扫描中占据图谱的低质量区。

母离子被碰撞击活后，贮存在离子阱中并在指定的时间内（Q3cooltime）发生裂解。

质量低于Q3fillmass的碎片离子从离子阱中甩出。

经过Q3冷却后，全质量范围的离子被贮存在离子阱中。

然后，贮存在离子阱中的离子扫描输出。

离子阱MS/MS扫描

MS/MS扫描也可以采用MS/MS/MS扫描功能在离子阱中执行。

在这种模式下，先在Q1中选择母离子。

不加碰撞能量，如多肽的质量可在离子阱中选择和分离。

现在，加在多肽上的激发能是其在离子阱中裂解。

这些碎片离子然后以三种扫描速度中的一种扫描输出。

Q0Trapping

Q0Trapping可以在大多数扫描方式中打开以增加扫描的灵敏度。

Q0Trapping打开时，离子源产生的离子在Q0中富集同时线性离子阱在扫描。

当离子阱准备再次充满时，离子从Q0中释放。

4.1创建硬件Profile

点击导航栏（屏幕的左边）中的HardwareConfiguration，打开HardwareConfigurationEditor，点击NewProfile创建一个新的硬件Profile并命名为“MS+syringe”。

选择AddDevice并从外围设备列表中选出MassSpectrometer。

点击OK使其出现在EditProfile窗口。

点击SetupDevice并检查小窗口下端box确保useintegratedsyringpump被击活。

点击OK回到HardwareConfigurationEditor。

回到HardwareConfigurationEditor之后，点击ActiveProfile。

电脑将与Profile中的设备建立通讯，checkmark变绿。

关闭编辑器。

4.2注射进样GluFibrinopeptideB

从菜单Tune中选择projects>Createproject创建一个新的project，命名为Training。

硬件Profile被击活后，点击导航栏（屏幕的左边）中的Tune，然后点击T图标使仪器进入“Ready”状态。

此时可听到气打开仪器被击活。

双击导航栏中的ManualTuning打开一个空白摸板。

1mL注射器中装入校正溶液置于QTRAP仪器的integrated注射泵上。

本例采用GluFibrinopeptideB溶液。

通过MSMethod从菜单中选择SyringPumpMethod，启动注射泵。

注射泵的直径和流速可以在下面的窗口中定义。

1mL注射器的直径为4.61mm（其它直径见附录）。

参数调整好后点击StartSyringPump。

流速为5-10uL/min。

注意：

如果进样开始后需要改变流速或注射泵的直径，输入新的值并点击SetFlowRate。

如果不点击SetFlowRate则改变无效。

4.3增强型全扫描（EMS）

EMS是一种标准的离子阱扫描方式。

离子源产生的离子通过四极杆（RFohly），进入离子阱。

离子阱充满后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。

从Scantype菜单中选择EnhancedMS扫描类型。

质量范围为400-1300。

TurboIonSpray离子源的Source/Gas的设定值如下所示。

如果采用FlowNanoSpray源，IS设为1000，GS1设为0。

Numberofscanstosum默认值为2，Cycles数设为5。

所以共10次扫描。

注意：

当扫描速度改变时（AdvancedMStab），需调整Cycles数。

该窗口中Duration时间为常数，Cycles数可调整。

Compound和AdvancedMS下的参数如下。

调整DeclusteringPotential增加样品表面解簇。

离子化多肽时40-50V比较好。

在AdvancedMS下选择需进行校正的扫描速度。

从4000amu/sec开始。

根据离子信号的强度调整Trapfilltime。

一般来说，默认的filltime为20ms。

对于比较浓的样品，5-10ms可以减少空间电荷增加分辨率。

浓度比较低的样品可以延长filltime为50ms。

这种扫描速度不选Q0Trapping。

不用调整Stepsize或Q3EntryBarrier。

采集方法被编好后，注射泵进样，可以开始采集数据。

点击Start键，采集开始，两个新的窗口出现在手动调谐窗口中。

左边的窗口为采集的总离子流图（TIC），代表每次扫描到达检测器的离子总数。

右边为当前的质谱图。

下图为一张代表性的GluFibrinopeptideB的EMS谱，采集时MCA被打开，数据为5次循环的加和，碎片离子峰的强度增加。

局部放大图谱，左击并沿X-轴下方在选定的区域附近拖拉鼠标。

双击X-轴下方，则恢复。

局部放大m/z684离子直到可以看见肽的所有同位素峰。

如果视图扩大得太远，可点击control键并点击谱图。

从右键菜单选择UndoZoom可缩小一级。

点击Acquire保存图谱，使用5次循环，MCA打开，Trapfilltim为20ms。

命名为GluFibEMS1000amu。

调整离子阱的filltime观察信号强度和峰形的改变。

注意到如果离子阱的filltime减少，峰的分辨率可能增加。

当检测浓度较大的样品，峰形会展宽，可能由于离子阱中空间电荷效应造成的。

减少filltime，较少的离子进入离子阱，减少空间电荷效应。

尝试不同的扫描速度，观察峰宽的改变。

降低扫描速度，可以增加分辨率，但是扫描时间变长。

4.4增强多电荷扫描（EMC）

EMC是一种标准的离子阱扫描方式，可用来提高多电荷离子的信噪比。

离子源产生的离子通过四极杆（RFohly），进入离子阱。

离子阱充满后，单电荷离子从离子阱中排空，主要留下多电荷离子。

然后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。

从Scantype菜单中选择EnhancedMulti-Charge扫描类型。

所有MS表的设定保持不变。

点击AdvancedMS表，Q3EmptyTime默认值为100ms。

该设定控制离子在离子阱中贮存和单电荷离子排空的时间。

该时间越长，信噪比增加越多。

注意：

多电荷离子强度也将减少，但速度低于单电荷离子。

点击Acquire进行EMC扫描，使用5次循环。

命名为GluFibEMCQ0trapping。

相对于多肽离子，背景离子减少。

而且相对于前面的EMS，GluFibrinopeptideB母离子的总数也增加。

这是由于Q0Trapping打开。

关闭Q0Trapping观察母离子的信号强度。

当Q0Trapping打开时，EMC扫描可以使信噪比大大提高。

在导航栏中，点击OpenDataFile选择GluFibEMS1000amu文件打开。

也打开GluFibEMCQ0trapping文件。

如果显示为全屏，则点击

，两张谱均可以看到。

点击Truck图标

（将变灰）拖拉一张谱到另一张谱的窗口中。

点击要移动的图谱，然后移动鼠标到窗口的边缘（出现一个叉箭头）。

点住鼠标不放，移动到另一个窗口放开。

两张谱放在了同一个窗口中。

通过点击窗口边缘的叉箭头并移动灰色的框到希望的位置，最终可以选择并排放置或上下放置。

多个窗口可以被拖拉到相同的窗口。

比较两次扫描的信噪比。

4.5增强分辨率扫描（ER）

这种扫描方式可以获得感兴趣离子的高分辨MS。

第一个质量扫描四极杆（Q1）设定质量窗口为感兴趣离子的左右6-8amu。

离子被贮存在离子阱中，在一个较窄的质量范围（~20amu）内以低扫描速度（250amu/sec）扫描输出。

这种扫描方式可以得到~0.15amuFWHM峰宽。

从Scantype菜单中选择EnhancedResolutionCenter窗口。

在窗口中输入多个质量数可以在一次实验中进行多个ER扫描。

设定循环数为5。

接下来，点击AdvancedMS表，默认的扫描速度为250amu/sec。

选择MCA，不选Q0Trapping。

点击Resolution表，默认的Q1的Resolution为Open。

点击Start，采集一次扫描然后点击Stop。

（有时如果前一次扫描选择了Q0Trapping，那么由于贮存在Q0中的离子释放出来，在下一次扫描的第一个循环可能有空间电荷。

）

点击Acquire，文件命名为GluFibER。

点击OK开始采集数据。

打开Q0Trapping采集另外一个数据文件命名为GluFibERQ0Ton。

当Q0Trapping打开时，下面一张图谱强度增加。

并且峰有一点展宽。

这张图谱有轻微的空间电荷效应。

打开View菜单中的GraphInfoWindow，测量峰宽。

用鼠标拖拉划过图谱中的一个峰，分辨率及峰中心的m/z值出现在窗口中。

GraphSelectionInfo窗口可以被docked，通过右击窗口并在AllowDocking打勾，使其成为视图的一部分。

现在将窗口移到NavigationToolBar下面，屏幕的左边。

GraphSelectionInfo窗口处于打开状态保存屏幕设置，方法为同时按住“0”（zero）和control键。

4.6增强型子离子扫描（EPI）

在这种模式下，先在Q1中选择母离子，滤掉其它所有的离子。

母离子在Q2碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。

产生的碎片离子被离子阱捕获；然后快速扫描输出。

从Scantype菜单中选择EnhancedProductIon扫描类型。

质量范围为100-1700。

当输入质量范围后，会分为两个独立的范围。

这种特征是自动优化选定质量范围的四极杆的传输步长。

改变质量范围的低端或高端，然后点击OptimizeMasses，可以调整扫描范围。

也可以将整个质量范围删除重新输入。

点灰需要删除的行然后点击Delete键，可以删除表中的行。

在ProductsOf框中输入母离子的质量数。

推荐输入小数点后一位，尤其是要根据产生的图谱使用BioAnalystSoftware序列工具时。

TurboIonSpray离子源的Source/Gas的设定值如下所示。

如果采用FlowNanoSpray源，IS设为1000，GS1设为0。

Numberofscanstosum的默认值为2。

循环数设为5，总扫描次数即为10。

Compound表和AdvancedMS表中的参数设置如下。

碰撞能将影响碰撞室中碎片的数目，这在采集过程中可以调节。

开始设为20eV。

开始采集后，碰撞能可以增加直到得到一张好的裂解图。

在AdvancedMS表中，扫描速度可以选择，开始时设为4000amu/sec。

不选择MCA。

为了增加扫描的灵敏度，可以选择Q0Trapping。

当Q0Trapping打开时，离子源产生的离子在Q0中富集同时线性离子阱在扫描。

接下来，点击Resolution表，设定Q1的Resolution为Open。

注意：

用户可以调节Q1中低分辨传输窗口的宽度。

在Tools菜单中，选择Setting和TuningOptions，调节低分辨的补偿drop。

0.1的分辨率补偿drop将穿过大约2-3Da宽的窗口，对于肽的MS/MS是一个好的设定值。

点击Start开始采集。

调整碰撞能，增加直到得到下面所示的碎片。

对于GluFibrinopeptide，碰撞能约为37eV。

碰撞能确定后，打开MCA，循环数设为5。

点击Acquire，文件命名为GluFibEPI4000amu。

点击OK开始采集数据。

分别收集选择和不选择Q0Trapping的图谱，比较其灵敏度差异。

选择1000amu/sec扫描速度，比较峰的分辨率。

4.7时间延迟碎裂扫描（TDF）

这种扫描方式可以简化肽的MS/MS谱的低质量区。

在TDF模式下，离子在Q2和Q3之间的低压区域被击活。

母离子被碰撞击活后，贮存在离子阱中并在指定的时间内（Q3cooltime）发生裂解。

质量低于Q3fillmass的碎片离子从离子阱中甩出。

经过Q3冷却后，全质量范围的离子被贮存在离子阱中。

然后，贮存在离子阱中的离子扫描输出。

从Scantype菜单中选择TimeDelayedFragmentationScan扫描类型。

在ProductsOf框中输入母离子的质量数，785.9。

推荐输入小数点后一位。

设定Q3fillmass为700（该质量数至少要比母离子低50amu，低于该质量数的图谱会受到时间延迟的影响）。

由于碎裂不在碰撞室中发生，所以在Compound表中将CollisionEnergy（CE）调节为10。

接下来，点击检查Resolution表，将Q1设定为Open。

注意：

Source/Gas表中的CollisionGas（CAD）调节为Medium以减少碰撞室中的压力，因此反应在Q2-Q3区域发生。

这也可以增加TDF扫描效果。

点击AdvancedMS表，设定裂解能量，TDFCE，为27V。

这个设定在采集过程中不能够改变。

对于同样一个多肽此处选择的裂解能量比EPI扫描时低~10V。

Q3cooltime是仅较高质量数的离子捕获在离子阱中的时间。

可以调节改变图谱的面貌，2-10ms，5ms为比较好的默认值。

点击Acquire，文件命名为GluFibTDF4000amu。

点击OK开始采集数据。

与EPI相比，对于同样一个多肽低质量区的图谱更为简单。

在导航栏中，点击OpenDataFile选择GluFibEPI4000amu文件打开。

也打开GluFibTDF4000amu文件。

Truck两张谱到一个窗口中进行比较，参见4.4增强多电荷扫描（EMC）。

比较两次扫描的碎片。

在TDF谱的低质量区，较高能量的碎片如b-ions和Internal碎片被除去了，图谱中主要留下小的y-ions。

这在手动确定多肽的denovo序列时，是很有用的信息。

4.8MS/MS/MS扫描

在这种模式下，先在Q1中选择一级母离子，该离子在碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。

产生的碎片离子进入离子阱中，其中一个碎片离子被选择性地分离出来（分离的宽度为1-5amu）。

分离之后，该离子被一个单波长激发频率所激发（激发宽度~1Da）发生裂解（激发能量可以由用户控制）。

产生的碎片离子被离子阱捕获；然后从离子阱中扫描输出。

从Scantype菜单中选择MS/MS/MSndPrecursor。

注意：

推荐均输入小数点后一位，2ndPrecursor作为excitation，宽度仅为1amu。

CollisionEnergy（CE）必需被输入Compound表中，产生二级离子，使用EPI扫描确定的~37V。

ExcitationEnergy（AF2）为裂解二级离子所需的能量数。

如果需要可以减小扫描的质量范围。

点击AdvancedMS表，观察MS/MS/MS裂解的新的设定值。

ExcitationTime的默认值为50ms。

该设定适用于大多数情况。

在Resolution表中，将Q1设定为LowResolution打开Q1四极杆的Transmission。

这将允许多肽的C12/C13同位素均通过Q1，可以给出较高的离子数和额外的电荷状态信息。

Q3Resolution也可以设定为Low，在线性离子阱中分离的二级离子的C12/C13同位素。

如果Q3选择UnitResolution，只有C12同位素被分离。

通过点击MS表中的NoFragmentation可以监测离子阱的分离效率。

点击NoFragmentation，然后点击Start开始采集。

观察C12/C13同位素在离子阱中的分离

情况。

改变Q3的分辨率，观察同位素在离子阱中的分离情况的改变。

优化碰撞能量，给出该离子的最大强度。

开始MS/MS/MS，停止采集，关闭NoFragmentation。

设定ExcitationEnergy（AF2）为130，Q3的分辨率设为Low并开始采集。

观察离子阱中产生的碎片。

采集过程中可以调节ExcitationEnergy。

关闭MCA，增加循环次数，调节AF2ExcitationEnergy的设定值，可以观察产生的效果。

在图谱的低质量区观察1/3rdcut-off，与3D离子阱相似。

这意味着在m/z值低于2ndPrecursor的m/z值30%时，观察不到碎片离子。

由于2ndPrecursor是在离子阱中分离出来的，为使离子在离子阱中稳定，需采用特定的q-值。

在此q-值下，m/z值为母离子的30%或更高的碎片离子在离子阱中稳定。

MS/MS扫描也可以采用MS/MS/MS扫描功能在离子阱中执行。

在这种模式下，先在Q1中选择母离子。

不加碰撞能量，多肽的质量在离子阱中选择和分离。

激发能量被使用，多肽在离子阱中裂解。

观察碰撞室中CAD碰撞裂解与离子阱中的激发裂解的差异将是很有意义的。

在某些情况下，离子阱的MS/MS可以产生对EPI扫描的补充信息。

设定1stPrecursor为785.9。

2ndPrecursor在离子阱中分离相同的质量数。

质量范围为100-1500。

如果不希望母离子在分离之前裂解，CollisionEnergy（CE）设为10V。

调节ExcitationEnergy（AF2）得到多肽在离子阱中的好的裂解图谱，120是一个比较恰当的值。

确定好能量值后，点击Acquire，文件命名为GluFibintrap。

在图谱的低质量区观察1/3rdcut-off，与3D离子阱相似。

在导航栏中，点击OpenDataFile选择GluFibEPI4000amu文件打开。

也打开GluFibintrap文件。

Truck两张谱到一个窗口中进行比较，参见4.4增强多电荷扫描（EMC）。

比较两次扫描所见的碎片。

附录

A．[Glu1]-FibrinopeptideB

这是一种比较好的多肽标准品，可以从Sigma（cat.#F-3261）购买。

浓度为500fmol/uL溶液可以给出比较强的校正信号。

溶剂为：

乙腈：

水（含0.1%的甲酸）=30：

100。

B．Hamilton注射器的内径表