Q TRAP系统的LIT扫描模式.docx

1、Q TRAP系统的LIT扫描模式Q TRAPTM系统的LIT扫描模式本指南包括线性离子阱（LIT）的各种扫描模式。该方法采用TurboIonSpray 离子源，正离子模式检测，用注射泵直接进样。GluFibrinopeptide B标准溶液的配制参见附录。增强型全扫描（EMS）EMS是一种标准的离子阱扫描方式。离子源产生的离子通过四极杆（RF ohly），进入离子阱。离子阱充满后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。增强多电荷扫描（EMC）EMC是一种标准的离子阱扫描方式，可用来提高多电荷离子的信噪比。离子源产生的离子通过四极杆（RF ohly），进入离子阱。离子阱充满后，单电荷离子从离子阱中排空，

2、主要留下多电荷离子。然后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。增强分辨率扫描（ER）这种扫描方式可以获得感兴趣离子的高分辨MS。第一个质量扫描四极杆（Q1）设定质量窗口为感兴趣离子的左右6-8amu。离子被贮存在离子阱中，在一个较窄的质量范围（20amu）内以低扫描速度（250amu/sec）扫描输出。这种扫描方式可以得到0.15amu FWHM峰宽。增强型子离子扫描（EPI）EPI用于获得特定离子的高品质的MS/MS谱。在碰撞室中发生裂解，从而提供丰富的MS/MS碰撞诱导裂解信息。在这种模式下，先在Q1中选择母离子，质量窗口宽度为1-4amu，滤掉其它所有的离子。母离子在Q2碰撞室中发生碰撞诱导裂

3、解（CAD）。产生的碎片离子被离子阱捕获；然后根据碎片离子分辨率的要求，以三种扫描速度中的一种扫描输出。MS/MS/MS扫描 MS/MS/MS扫描可用于获得特定MS/MS离子的进一步的信息，在这种模式下，先在Q1中选择一级母离子，质量窗口宽度为1-4amu，该离子在碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。产生的碎片离子进入离子阱中，其中一个碎片离子被选择性地分离出来（分离的宽度为1-5amu）。分离之后，该离子被一个单波长激发频率所激发（激发宽度1Da）发生裂解（激发能量可以由用户控制）。产生的碎片离子被离子阱捕获；然后以三种扫描速度中的一种扫描输出。时间延迟碎裂扫描（TDF）这种扫描方式可以简化

4、MS/MS谱的低质量区。TDF扫描之后，低质量区主要为y-离子，因而这种扫描方式是确定多肽de novo序列的有力工具。在TDF模式下，离子在Q2和Q3之间的低压区域被击活。由于低压，被击活离子弛豫速率降低。能量较高的离子（能够产生次级碎片离子，使低质量部分的图谱复杂化）将快速裂解不在离子阱中贮存。能量较高的碎片离子将贮存在离子阱中，在TDF扫描中占据图谱的低质量区。母离子被碰撞击活后，贮存在离子阱中并在指定的时间内（Q3 cool time）发生裂解。质量低于Q3 fill mass的碎片离子从离子阱中甩出。经过Q3冷却后，全质量范围的离子被贮存在离子阱中。然后，贮存在离子阱中的离子扫描输出

5、。离子阱MS/MS扫描MS/MS扫描也可以采用MS/MS/MS扫描功能在离子阱中执行。在这种模式下，先在Q1中选择母离子。不加碰撞能量，如多肽的质量可在离子阱中选择和分离。现在，加在多肽上的激发能是其在离子阱中裂解。这些碎片离子然后以三种扫描速度中的一种扫描输出。Q0 Trapping Q0 Trapping可以在大多数扫描方式中打开以增加扫描的灵敏度。Q0 Trapping打开时，离子源产生的离子在Q0中富集同时线性离子阱在扫描。当离子阱准备再次充满时，离子从Q0中释放。 4.1 创建硬件Profile 点击导航栏(屏幕的左边)中的Hardware Configuration，打开Hardw

6、are Configuration Editor，点击New Profile创建一个新的硬件Profile并命名为“MS+syringe”。选择Add Device 并从外围设备列表中选出Mass Spectrometer。点击OK使其出现在Edit Profile窗口。点击Setup Device并检查小窗口下端box确保use integrated syring pump被击活。点击OK回到Hardware Configuration Editor。回到Hardware Configuration Editor之后，点击Active Profile。电脑将与Profile中的设备建立通讯，

7、checkmark变绿。关闭编辑器。4.2 注射进样GluFibrinopeptide B从菜单Tune中选择projectsCreate project 创建一个新的project，命名为Training。硬件Profile被击活后，点击导航栏(屏幕的左边)中的Tune，然后点击T图标使仪器进入“Ready”状态。此时可听到气打开仪器被击活。双击导航栏中的Manual Tuning打开一个空白摸板。1mL注射器中装入校正溶液置于QTRAP仪器的integrated注射泵上。本例采用GluFibrinopeptide B溶液。通过MS Method从菜单中选择Syring Pump Metho

8、d，启动注射泵。注射泵的直径和流速可以在下面的窗口中定义。1mL注射器的直径为4.61mm（其它直径见附录）。参数调整好后点击Start Syring Pump。流速为5-10uL/min。注意：如果进样开始后需要改变流速或注射泵的直径，输入新的值并点击Set Flow Rate。如果不点击Set Flow Rate则改变无效。4.3增强型全扫描（EMS）EMS是一种标准的离子阱扫描方式。离子源产生的离子通过四极杆（RF ohly），进入离子阱。离子阱充满后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。从Scan type菜单中选择Enhanced MS扫描类型。质量范围为400-1300。TurboIon

9、Spray离子源的Source/Gas的设定值如下所示。如果采用Flow NanoSpray源，IS设为1000，GS1设为0。Number of scans to sum默认值为2，Cycles数设为5。所以共10次扫描。注意：当扫描速度改变时（Advanced MS tab），需调整Cycles数。该窗口中Duration时间为常数， Cycles数可调整。Compound和Advanced MS下的参数如下。调整Declustering Potential增加样品表面解簇。离子化多肽时40-50V比较好。 在Advanced MS下选择需进行校正的扫描速度。从4000amu/sec开始。

10、根据离子信号的强度调整Trap fill time。一般来说，默认的fill time为20ms。对于比较浓的样品，5-10ms可以减少空间电荷增加分辨率。浓度比较低的样品可以延长fill time为50ms。 这种扫描速度不选Q0 Trapping。不用调整Step size或Q3 Entry Barrier。采集方法被编好后，注射泵进样，可以开始采集数据。点击Start键，采集开始，两个新的窗口出现在手动调谐窗口中。左边的窗口为采集的总离子流图（TIC），代表每次扫描到达检测器的离子总数。右边为当前的质谱图。下图为一张代表性的GluFibrinopeptide B的EMS谱，采集时MCA被

11、打开，数据为5次循环的加和，碎片离子峰的强度增加。局部放大图谱，左击并沿X-轴下方在选定的区域附近拖拉鼠标。双击X-轴下方，则恢复。局部放大 m/z 684离子直到可以看见肽的所有同位素峰。如果视图扩大得太远，可点击control键并点击谱图。从右键菜单选择Undo Zoom可缩小一级。点击Acquire保存图谱，使用5次循环，MCA打开，Trap fill tim为20ms。命名为GluFib EMS 1000amu。调整离子阱的fill time观察信号强度和峰形的改变。注意到如果离子阱的fill time减少，峰的分辨率可能增加。当检测浓度较大的样品，峰形会展宽，可能由于离子阱中空间电荷

12、效应造成的。减少fill time，较少的离子进入离子阱，减少空间电荷效应。尝试不同的扫描速度，观察峰宽的改变。降低扫描速度，可以增加分辨率，但是扫描时间变长。4.4增强多电荷扫描（EMC）EMC是一种标准的离子阱扫描方式，可用来提高多电荷离子的信噪比。离子源产生的离子通过四极杆（RF ohly），进入离子阱。离子阱充满后，单电荷离子从离子阱中排空，主要留下多电荷离子。然后，离子沿轴向扫描输出到达检测器。从Scan type菜单中选择Enhanced Multi-Charge扫描类型。所有MS表的设定保持不变。 点击Advanced MS表，Q3 Empty Time默认值为100ms。该设定

13、控制离子在离子阱中贮存和单电荷离子排空的时间。该时间越长，信噪比增加越多。注意：多电荷离子强度也将减少，但速度低于单电荷离子。点击Acquire进行EMC扫描，使用5次循环。命名为GluFib EMC Q0trapping。相对于多肽离子，背景离子减少。而且相对于前面的EMS，GluFibrinopeptide B母离子的总数也增加。这是由于Q0 Trapping打开。关闭Q0 Trapping观察母离子的信号强度。当Q0 Trapping打开时，EMC扫描可以使信噪比大大提高。在导航栏中，点击Open Data File选择GluFib EMS 1000amu文件打开。也打开GluFib E

14、MC Q0trapping文件。如果显示为全屏，则点击，两张谱均可以看到。点击Truck图标（将变灰）拖拉一张谱到另一张谱的窗口中。点击要移动的图谱，然后移动鼠标到窗口的边缘（出现一个叉箭头）。点住鼠标不放，移动到另一个窗口放开。两张谱放在了同一个窗口中。通过点击窗口边缘的叉箭头并移动灰色的框到希望的位置，最终可以选择并排放置或上下放置。多个窗口可以被拖拉到相同的窗口。比较两次扫描的信噪比。4.5增强分辨率扫描（ER）这种扫描方式可以获得感兴趣离子的高分辨MS。第一个质量扫描四极杆（Q1）设定质量窗口为感兴趣离子的左右6-8amu。离子被贮存在离子阱中，在一个较窄的质量范围（20amu）内以低

15、扫描速度（250amu/sec）扫描输出。这种扫描方式可以得到0.15amu FWHM峰宽。从Scan type菜单中选择Enhanced ResolutionCenter窗口。在窗口中输入多个质量数可以在一次实验中进行多个ER扫描。设定循环数为5。接下来，点击Advanced MS表，默认的扫描速度为250amu/sec。选择MCA，不选Q0 Trapping。点击Resolution表，默认的Q1的Resolution为Open。点击Start，采集一次扫描然后点击Stop。（有时如果前一次扫描选择了Q0 Trapping，那么由于贮存在Q0中的离子释放出来，在下一次扫描的第一个循环可能有

16、空间电荷。）点击Acquire，文件命名为GluFib ER。点击OK开始采集数据。打开Q0 Trapping采集另外一个数据文件命名为GluFib ER Q0T on。当Q0 Trapping打开时，下面一张图谱强度增加。并且峰有一点展宽。这张图谱有轻微的空间电荷效应。打开View 菜单中的Graph Info Window，测量峰宽。用鼠标拖拉划过图谱中的一个峰，分辨率及峰中心的m/z值出现在窗口中。Graph Selection Info窗口可以被docked，通过右击窗口并在Allow Docking打勾，使其成为视图的一部分。现在将窗口移到Navigation Tool Bar下面，

17、屏幕的左边。Graph Selection Info窗口处于打开状态保存屏幕设置，方法为同时按住“0”（zero）和control键。4.6增强型子离子扫描（EPI）在这种模式下，先在Q1中选择母离子，滤掉其它所有的离子。母离子在Q2碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。产生的碎片离子被离子阱捕获；然后快速扫描输出。从Scan type菜单中选择Enhanced Product Ion扫描类型。质量范围为100-1700。当输入质量范围后，会分为两个独立的范围。这种特征是自动优化选定质量范围的四极杆的传输步长。改变质量范围的低端或高端，然后点击Optimize Masses，可以调整扫描范围。也

18、可以将整个质量范围删除重新输入。点灰需要删除的行然后点击Delete键，可以删除表中的行。在Products Of框中输入母离子的质量数。推荐输入小数点后一位，尤其是要根据产生的图谱使用BioAnalyst Software序列工具时。TurboIonSpray离子源的Source/Gas的设定值如下所示。如果采用Flow NanoSpray源，IS设为1000，GS1设为0。Number of scans to sum 的默认值为2。循环数设为5，总扫描次数即为10。Compound表和Advanced MS表中的参数设置如下。碰撞能将影响碰撞室中碎片的数目，这在采集过程中可以调节。开始设为

19、20eV。开始采集后，碰撞能可以增加直到得到一张好的裂解图。在Advanced MS表中，扫描速度可以选择，开始时设为4000amu/sec。不选择MCA。为了增加扫描的灵敏度，可以选择Q0 Trapping。当Q0 Trapping打开时，离子源产生的离子在Q0中富集同时线性离子阱在扫描。接下来，点击Resolution表，设定Q1的Resolution为Open。注意：用户可以调节Q1中低分辨传输窗口的宽度。在Tools菜单中，选择Setting和Tuning Options，调节低分辨的补偿drop。0.1的分辨率补偿drop将穿过大约2-3Da宽的窗口，对于肽的MS/MS是一个好的设定

20、值。点击Start开始采集。调整碰撞能，增加直到得到下面所示的碎片。对于GluFibrinopeptide，碰撞能约为37eV。碰撞能确定后，打开MCA，循环数设为5。点击Acquire，文件命名为GluFib EPI 4000amu。点击OK开始采集数据。分别收集选择和不选择Q0 Trapping的图谱，比较其灵敏度差异。选择1000amu/sec 扫描速度，比较峰的分辨率。4.7 时间延迟碎裂扫描（TDF）这种扫描方式可以简化肽的MS/MS谱的低质量区。在TDF模式下，离子在Q2和Q3之间的低压区域被击活。母离子被碰撞击活后，贮存在离子阱中并在指定的时间内（Q3 cool time）发生裂

21、解。质量低于Q3 fill mass的碎片离子从离子阱中甩出。经过Q3冷却后，全质量范围的离子被贮存在离子阱中。然后，贮存在离子阱中的离子扫描输出。从Scan type菜单中选择Time Delayed Fragmentation Scan 扫描类型。在Products Of框中输入母离子的质量数，785.9。推荐输入小数点后一位。设定Q3 fill mass为700（该质量数至少要比母离子低50amu，低于该质量数的图谱会受到时间延迟的影响）。由于碎裂不在碰撞室中发生，所以在Compound表中将Collision Energy（CE）调节为10。接下来，点击检查Resolution表，将Q

22、1设定为Open。注意：Source/Gas表中的Collision Gas（CAD）调节为Medium以减少碰撞室中的压力，因此反应在Q2-Q3区域发生。这也可以增加TDF扫描效果。点击Advanced MS表，设定裂解能量，TDF CE，为27V。这个设定在采集过程中不能够改变。对于同样一个多肽此处选择的裂解能量比EPI扫描时低10V。Q3 cool time是仅较高质量数的离子捕获在离子阱中的时间。可以调节改变图谱的面貌，2-10ms，5ms为比较好的默认值。点击Acquire，文件命名为GluFib TDF 4000amu。点击OK开始采集数据。与EPI相比，对于同样一个多肽低质量区的

23、图谱更为简单。在导航栏中，点击Open Data File选择GluFib EPI 4000amu文件打开。也打开GluFib TDF 4000amu文件。Truck两张谱到一个窗口中进行比较，参见4.4增强多电荷扫描（EMC）。比较两次扫描的碎片。在TDF谱的低质量区，较高能量的碎片如b-ions和Internal碎片被除去了，图谱中主要留下小的y-ions。这在手动确定多肽的de novo序列时，是很有用的信息。4.8 MS/MS/MS扫描在这种模式下，先在Q1中选择一级母离子，该离子在碰撞室中发生碰撞诱导裂解（CAD）。产生的碎片离子进入离子阱中，其中一个碎片离子被选择性地分离出来（分离

24、的宽度为1-5amu）。分离之后，该离子被一个单波长激发频率所激发（激发宽度1Da）发生裂解（激发能量可以由用户控制）。产生的碎片离子被离子阱捕获；然后从离子阱中扫描输出。从Scan type菜单中选择MS/MS/MSnd Precursor。注意：推荐均输入小数点后一位，2nd Precursor作为excitation，宽度仅为1amu。Collision Energy（CE）必需被输入Compound表中，产生二级离子，使用EPI扫描确定的37V。Excitation Energy（AF2）为裂解二级离子所需的能量数。如果需要可以减小扫描的质量范围。点击Advanced MS表，观察MS

25、/MS/MS裂解的新的设定值。Excitation Time的默认值为50ms。该设定适用于大多数情况。在Resolution表中，将Q1设定为Low Resolution 打开Q1四极杆的Transmission。这将允许多肽的C12/C13同位素均通过Q1，可以给出较高的离子数和额外的电荷状态信息。Q3 Resolution也可以设定为Low，在线性离子阱中分离的二级离子的C12/C13同位素。如果Q3选择 Unit Resolution，只有C12同位素被分离。通过点击MS表中的No Fragmentation可以监测离子阱的分离效率。点击No Fragmentation，然后点击Sta

26、rt开始采集。观察C12/C13同位素在离子阱中的分离情况。改变Q3的分辨率，观察同位素在离子阱中的分离情况的改变。优化碰撞能量，给出该离子的最大强度。开始MS/MS/MS，停止采集，关闭No Fragmentation。设定Excitation Energy（AF2）为130，Q3的分辨率设为Low并开始采集。观察离子阱中产生的碎片。采集过程中可以调节Excitation Energy。关闭MCA，增加循环次数，调节AF2Excitation Energy的设定值，可以观察产生的效果。在图谱的低质量区观察1/3rd cut-off，与3D离子阱相似。这意味着在m/z值低于2nd Precur

27、sor 的m/z值30%时，观察不到碎片离子。由于2nd Precursor是在离子阱中分离出来的，为使离子在离子阱中稳定，需采用特定的q-值。在此q-值下，m/z值为母离子的30%或更高的碎片离子在离子阱中稳定。MS/MS扫描也可以采用MS/MS/MS扫描功能在离子阱中执行。在这种模式下，先在Q1中选择母离子。不加碰撞能量，多肽的质量在离子阱中选择和分离。激发能量被使用，多肽在离子阱中裂解。观察碰撞室中CAD碰撞裂解与离子阱中的激发裂解的差异将是很有意义的。在某些情况下，离子阱的MS/MS可以产生对EPI扫描的补充信息。设定1st Precursor为785.9。2nd Precursor在

28、离子阱中分离相同的质量数。质量范围为100-1500。如果不希望母离子在分离之前裂解，Collision Energy （CE）设为10V。调节Excitation Energy（AF2）得到多肽在离子阱中的好的裂解图谱，120是一个比较恰当的值。确定好能量值后，点击Acquire，文件命名为GluFib in trap。在图谱的低质量区观察1/3rd cut-off，与3D离子阱相似。在导航栏中，点击Open Data File选择GluFib EPI 4000amu文件打开。也打开GluFib in trap文件。Truck两张谱到一个窗口中进行比较，参见4.4增强多电荷扫描（EMC）。比较两次扫描所见的碎片。附录AGlu1-Fibrinopeptide B 这是一种比较好的多肽标准品，可以从Sigma（cat.#F-3261）购买。浓度为500fmol/uL溶液可以给出比较强的校正信号。溶剂为：乙腈：水（含0.1%的甲酸）=30：100。BHamilton注射器的内径表