漆酶提纯分离.docx
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漆酶提纯分离
漆酶的提取纯化及其脱色研究
摘要
【目的】本实验通过选取一株突变的高产漆酶的粗毛栓菌发酵液〔培养11天产生漆酶酶活最高〕，经过离心沉淀过滤，硫酸铵沉淀，SephadexG-75凝胶过柱层析，别离纯化漆酶以及测定其纯化相关参数，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定各步别离后的成分变化。
最后研究其脱色的效果，为漆酶应用的相关研究提供实验依据。
【方法】利用过滤，硫酸铵沉淀，SephadexG-75凝胶过柱层析，的方法提取纯化漆酶，SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定别离成分，并用光密度测漆酶的脱色率。
【实验材料】发酵液，相关试剂【预计结果】选用凝胶浓度为12%，结果可以明显看出，经过纯化的漆酶的条带是单一的，相关参数〔蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数〕比较高，另外，脱色效果比较显著。
【结论】
关键词
漆酶纯化脱色应用
1前言
实验的研究意义
木质素是植物中产生的一类难于降解的高分子化合物的统称，主要由苯丙烷单元通过醚键和碳键等多种共价键连接而成的杂聚物，是自然界中碳循环的限速环节之一。
其降解主要由微生物完成，这类微生物主要包括真菌、放线菌和细菌。
其中白腐真菌〔whiterotfungi〕被认为是生物圈中植物天然高分子物质木质素、纤维素和半纤维素的重要降解者，能使这些物质最终分解为二氧化碳和水。
白腐真菌通常通过分泌木质素过氧化物酶〔Ligninperoxidase，Lip〕、锰过氧化物酶〔Manganeseperoxidase，MnP〕和漆酶〔Laccase，Ec.2〕三种主要的木质素降解酶类来降解木质素。
其中漆酶，能够将木质素降解为CO2和H2O，反应过程不需要H2O2的参与，在木质素降解中起主要作用。
其中漆酶〔Laccase〕是一种多酚氧化酶〔p-diphenoloxidaseEC..2〕，属于蓝色氧化酶家族。
漆酶能催化降解多种芳香族化合物特别是酚类，是一种天然环保型酵素。
因而在纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工、生物质能源等领域具有广阔的应用前景，利用漆酶对木质纤维及一些高分子化合物的降解作用，进行合理的开发利用，可减少化学药品的使用量，降低生产成本和保护环境。
本实验通过过滤，硫酸铵沉淀，凝胶层析柱，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法提取纯化漆酶,结果蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数都取得较好的效果，对于漆酶的别离、提纯及其天然结构和生理功能的研究中有重要的作用。
漆酶的脱色实验很好的证明了漆酶的重要用途，为漆酶的实用性，工业用途提供了实验平台。
实验的创新性
在以往的漆酶的提取纯化过程中，要做到蛋白含量，活力回收，比活力，纯化倍数同时较高是比较困难的，尤其是最后得到的漆酶不仅酶量少，而且酶活较低。
在本实验中，我们经过多步骤纯化，并注意保持其酶活，最后得到的漆酶酶活高，纯度高。
目前，我们从所查阅的大量参考文献中可知，漆酶的脱色反应操作比较困难，主要原因为无法提取纯度较高的酶，或者最后得到的漆酶酶活太低，导致脱色效果不明显。
因此，漆酶的脱色反应一直没有被广泛应用。
我们设计这个实验以纯化提取为基础，具有可行性强、操作简单、方便等特点。
为漆酶的脱色应用的研究提供一个参考实验。
2实验目的
〔1〕得出一种能别离，纯化漆酶并保持较高酶活的方法。
〔2〕完成漆酶的一个重要的应用—脱色反应，为漆酶的实际应用提供实验研究基础。
3实验原理
硫酸铵沉淀法
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水集团与水形成水化膜的成都以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当有中性盐加入蛋白质溶液时，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质外表电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
【*】
SephadexG-75凝胶过柱层析
凝胶过滤层析是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被别离物质的分子大小不同来进行别离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，小分子物质能进入其内部，流出速度慢，而大分子物质却被排除在外部，流出速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子大小筛分开。
根据查阅相关文献，粗毛栓菌主要【*】，因此，本试验采用SephadexG-75〔葡聚糖凝胶G-75〕填料，孔径相对分子量范围2kD~70kD。
3.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以丙烯酰胺为单体，N，N’-甲叉丙烯酰胺为交联剂，在催化剂〔过硫酸铵〕和引发剂〔TEMED〕的作用下，聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构。
这种网状结构具有分子筛效应，别离分子通过网孔的能力取决于凝胶孔大小和形状，也取决于被别离分子的形状及大小，但在SDS-聚丙烯酰胺电泳中，蛋白质与SDS形成蛋白质-SDS复合物，由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异，而且，其还引起了蛋白质构象的改变，使蛋白质的电泳迁移率只与其质量有关，因此可以测定蛋白质的相对分子质量及别离提纯蛋白质。
【*】
3.4A280测定蛋白浓度
蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。
3.5漆酶活性测定
漆酶〔Laccases,EC.2〕活力的测定，参照文献【*】，采用ABTS[2，2-azino-bis〔3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid〕]法。
反应体系含有1.95ml0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液〔pH4.0〕、2.00ml0.5mmol/L连氮-二〔3-乙基苯并噻唑-6-磺酸〕〔ABTS〕溶液和经适当稀释的酶液50uL，于28℃启动反应并连续测定反应液在3min内于420nm〔ε=3.6×104cm-1mol-1L〕处吸光值的增加值。
定义该条件下，每分钟使1umol/LABTS转化所需的酶量定为1个活力单位〔U〕。
漆酶活力计算公式如下：
漆酶活力〔U/L〕=n×△A×106×V总/=3.6×104×3×V酶
式中：
n为酶液稀释倍数
V总为反应总体积
V酶为反应酶液体积
△A为反应液在3min内在420nm处吸光值的变化值
3为反应时间〔min〕
3.6×104为ABTS氧化态的摩尔吸光系数〔cm-1mol-1L〕
3.6漆酶的脱色测定
由于漆酶具有单电子氧化复原电位高、催化活性强等特点,可以氧化芳香环化合物,对染料的脱色及降解效果明显。
在紫外可见分光光度计上可得到不同的吸光值，用于比较其脱色效果。
4实验设备
表1实验设备
名称
规格
数目
备注
冰箱
----
1台
4℃
电热恒温水浴锅
----
1台
电子天平
----
1台
电子分析天平
----
1台
紫外分光光度计
----
1台
恒流泵
----
1台
微量加样器
50μL
1支
凝胶成像系统
----
1套
大型冷冻离心机
1台
自动部分收集器
----
1台
配套30支小试管
玻璃层析柱
柱长28cm、柱直径1.5cm
1支
移液枪
5mL、1mL、200μL
各1支
配套枪头
稳压稳流电泳仪
----
1台
水平振荡器
----
1
量筒
50mL、200ml、500mL、1L
各一个
烧杯
50mL、100mL、500mL
夹心式垂直板电泳仪
各品牌皆可
1台
玻璃板、薄胶条、夹子、梳子、导线
吸管
----
试剂瓶
剪刀
----
玻璃棒
----
3支
试管
10ml
20个
配套试管架：
2个
胶塞
锥形瓶
玻璃管
乳胶管
-----
1米
圆底烧瓶
1L
1个
接液管
------
1个
铁架台
------
1个
含有夹子等
酸式滴定管
------
1支
50mL
标签纸
-------
假设干
广泛pH试纸
----
一包
保鲜膜
----
1卷
纸卷
----
1卷
5实验材料及试剂
5.1实验材料
由华南农业大学生物技术研究所提供高产漆酶粗毛栓菌发酵粗酶液
5.2实验试剂
表2实验试剂
试剂名称
规格
丙烯酰胺〔Acr〕
分析纯
甲叉双丙烯酰胺〔Bis〕
分析纯
浓盐酸
分析纯
氯化钠
分析纯
磷酸二氢钠
分析纯
磷酸氢二钠
分析纯
过硫酸铵〔AP〕
生化试剂
四甲基乙二胺〔TEMED〕
生化试剂
标准蛋白Marker
生化试剂
三羟甲基氨基甲烷〔Tris〕
生化试剂
SDS
分析纯
甘氨酸
生化试剂
甘油
分析纯
二硫代苏糖醇〔DTT〕
分析纯
β-巯基乙醇
分析纯
冰乙酸
----
硫酸铵
分析纯
考马斯亮蓝R-250
分析纯
考马斯亮蓝G-250
分析纯
甲醇
----
无水氯化钙
----
葡聚糖凝胶G-75
----
凡士林
----
溴酚蓝
分析纯
硼酸
分析纯
甲基红
分析纯
溴甲酚氯或次甲基蓝
分析纯
氧化镁
-----
碳酸钠
分析纯
无水乙醇
分析纯
氢氧化钠
分析纯
PEG20000
分析纯
5.3硫酸铵沉淀相关试剂配备
PBS溶液〔pH6.8〕：
2HPO42PO4混合后定容至1L。
5.4SephadexG-75凝胶准备及相关试剂配制
5.4.1SephadexG-75凝胶准备
1.从厂家提供的溶胀系数和需要的装柱的大约柱床体积计算需要的凝胶干粉的量。
将计算量的凝胶干粉加入到两倍的计算凝胶终体积的凝胶过滤脱盐缓冲液中。
2.用玻璃棒小心搅拌悬液，让凝胶室温条件下溶胀过夜，或90℃水浴3h，适时搅拌保持凝胶呈悬浮状。
3.让凝胶沉淀，轻轻倒出雾状溶液以除去细小和破碎的凝胶颗粒。
重复这一步骤，直到凝胶沉淀床清晰可见，然后将其稀释，使凝胶沉淀床和凝胶过滤缓冲液体积比为1：
1。
5.4.2相关试剂配制
1.洗脱缓冲液〔pH7.50.05mol/LTris-HCl溶液〕：
50mL0.1mol/LTris溶液与40.3mL0.1mol/L盐酸混匀后，加蒸馏水定容至100mL。
5.5SDS-PAGE电泳凝胶相关试剂的配制
1.30%丙烯酰胺凝胶贮备液：
取30g丙烯酰胺〔Acr〕和双丙烯酰胺〔Bis〕冗余蒸馏水中，定容至100mL，过滤后4℃下贮存备用。
2.10%过硫酸铵〔AP〕溶液：
称取0g过硫酸铵溶解于1ml蒸馏水中，现配现用。
3.10%四甲基乙二胺〔TEMED〕：
取四甲基乙二胺〔TEMED〕，加蒸馏水溶解，定容至2mL。
4〔三羟甲基氨基甲烷〕溶解后，加1mol/LHCl溶液约48mL，调pH至8.8定容至100mL。
5〔三羟甲基氨基甲烷〕溶解后，加加1mol/LHCl溶液约20mL，调pH至6.8定容至50mL。
6.10%SDS溶液：
取5gSDS加蒸馏水溶解并定容至50ml。
7.样品缓冲液〔0.1%SDS-1%巯基乙醇-或20%甘油-0.02%溴酚蓝-0.2%SDS〕：
取β巯基乙醇、10ml甘油、0.1mL0.5%溴酚蓝、1mL10%SDS溶液，用蒸馏水定容至50mL。
8.电极缓冲液〔0.1%SDS-0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3〕：
取Tris、甘氨酸和SDS加水溶解后，调pH值至8.3，定容至1000mL。
9.染色液〔0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇溶液-10%冰乙酸溶液〕：
取考马斯亮蓝R-250，加入45mL甲醇溶液、10mL冰乙酸，用蒸馏水定容至100mL。
10.脱色液〔7.5%冰乙酸-5%甲醇溶液〕：
取75mL冰乙酸、50mL甲醇溶液，加蒸馏水定容至1000mL。
11.指示剂〔0.5%溴酚蓝溶液〕：
去溴酚蓝，加蒸馏水溶解，定容至50mL。
5.4材料的处理
发酵液的处理
用最正确培养基发酵高产漆酶粗毛栓菌，培养11天停止发酵，10000rad/min离心10分钟，取上清液，抽滤除去菌丝体等杂质，得到发酵液，置于4℃冰箱保存。
6实验操作步骤
〔因所需时间较长，所以在正式实验前完成〕
〔1〕在100mL发酵液中缓慢加入硫酸铵粉末，并温和搅拌〔冰浴中〕，直至终浓度到达45%，4℃静置过夜后10000r/min、4℃、离心30min，分别收集上清液和沉淀。
一级沉淀产物用适量PBS溶液溶解，得到一级沉淀粗酶液。
分别测定上清液和一级沉淀粗酶液的酶活。
一级沉淀溶解液置于4℃冰箱，备用，用于SDS-PAGE电泳。
〔2〕在步骤〔1〕中得到的上清液继续缓慢加入硫酸铵粉末，并温和搅拌〔冰浴中〕，直至终浓度到达45%，4℃静置过夜后10000r/min、4℃、离心30min，分别收集上清液和沉淀。
二级沉淀产物用适量PBS溶液溶解，得到二级沉淀粗酶液。
分别测定上清液和二级沉淀溶解液的酶活。
二级沉淀粗酶液取出少量样品置于4℃冰箱，用于SDS-PAGE电泳
〔3〕将所得二级沉淀粗酶液放入截留相对分子量为6kD的透析袋中，排除多余的空气，扎紧两端，透析袋上覆盖聚乙二醇20000，4℃放置约2～3h，当透析袋中酶样品浓缩到需要体积时，将用蒸馏水冲洗净袋体上的聚乙二醇20000，然后取出样品，置于4℃冰箱，用于凝胶过柱层析。
〔1〕装柱：
将层析柱垂直固定在铁架台上，缓缓搅拌凝胶悬浮液，然后慢慢倒入预先置好的层析柱中。
倾倒完毕，下端出口管用螺旋夹控制，勿产生气泡。
当凝胶已完全沉降后，保持液面在凝胶床外表以上，最后放入略小于层析柱内径的滤纸片，保护凝胶床面，盖上上盖。
〔2〕平衡：
连接好恒流泵，继续用洗脱液平衡，调整恒流泵流量使胶床外表保持2cm液层，并使流速为0.5ml/min，平衡30分钟。
〔3〕上样：
当胶床外表仅留约1mm液层时，吸取1mL二级沉淀粗酶液样品，小心地注入层析柱胶床面中央，慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入叫胶床，床面仅有1mm液层时，用滴管加入少量洗脱液，使剩余样品进入胶床，然后滴管小心加入2~5cm高的洗脱液。
〔4〕洗脱：
用洗脱缓冲液洗脱，继续控制流速为0.5ml/min，开启部分收集器，4min/管，2mL/管，分管受集流出液。
〔5〕测定蛋白含量以及漆酶活力：
以洗脱液为空白对照，于A280测定每个收集管的OD值，连续测定30管，绘制以分光度为纵坐标，收集管号为横坐标的曲线。
选取A280OD值不为零的搜集管用ABTS法测定漆酶酶活，绘制以漆酶活力为纵坐标，收集管号为横坐标的曲线。
〔6〕把酶活较高的收集液合并到一管，测定其酶活，取样用于SDS-PAGE凝胶电泳。
6.3不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备
表3SDS-PAGE不连续系统别离胶和浓缩胶的配制
加样顺序
试剂名称
封胶
12%别离胶所需试剂量
5%浓缩胶液所需试剂量
1
30%凝胶贮液
2000μL
4000μl
810μl
2
浓缩胶缓冲贮液〔pH6.8〕
--
--
2500μl
3
别离胶缓冲贮液〔pH8.8〕
--
5000μl
--
4
去离子水
6000μL
650μl
1500μl
5
10%过硫酸铵
120μl
150μl
70μl
6
TEMED
200μl
100μl
70μl
〔1〕用2块干净的玻璃平板和垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。
〔2〕将配好的别离胶溶液沿夹层中一片垫片的边缘加入于玻璃夹层中，上面封1-2ml去离子水，室温下聚合30~60min。
〔3〕倾去上层水，将配好的浓缩胶溶液沿夹层加入玻璃夹层中，直至离夹层的顶部约1cm高为止。
〔4〕将梳子插入夹层的浓缩胶液体中，室温下聚合30~45min。
〔5〕在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS样品缓冲液按1：
1〔v/v〕稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸3~5min。
同样缓冲液溶解蛋白质相对分子量标准混合物。
〔6〕小心地拔出梳子，将玻璃平板安装在电泳装置上，倒入1×SDS电泳电极缓冲液，使之淹没凝胶的加样孔。
电泳过程
表4不连续SDS-PAGE电泳点样表
胶孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
样品名称
Marker
发酵液
一级沉淀粗酶液
二级沉淀粗酶液
过柱后纯化酶液
点样量
10μL
10μL
10μL
10μL
10μL
〔1〕样品要加入3μL样品缓冲液以及指示剂，按表4用微量注射器点样。
〔2〕连接电源，先在5mA恒流下电泳至溴酚蓝指示剂从积层胶进入别离胶，再将电流调至10mA至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部为止。
〔3〕关闭电源并撤去导线，弃去电极缓冲液。
〔4〕将凝胶剥离出来并切去凝胶的一角做上标记。
染色及脱色
〔1〕将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器中并以3~5倍体积的考马斯亮蓝R-250固定染色液覆盖，在旋转摇床上缓慢摇动1~2h。
〔2〕倾去固定染色液，以脱色液覆盖凝胶，缓慢摇动，开始时每隔15分钟更换一次脱色液，之后每30分钟更换一次染色液，直至获得蓝色条带及干净的背景。
拍照存档。
6.4 漆酶对染料脱色的研究
染料吸收光谱的测定
配制考马斯亮蓝G-250染料溶液,以去离子水为参比,在UV23100紫外可见分光光度计上对其进行紫外-可见光区〔200～800nm〕光谱扫描,得到染料的最大吸收波长。
6.4.2 染料脱色试验
脱色的反应体系:
考马斯亮蓝的终浓度为100mg/L,按酶液与染料液1:
3加入,同时添加一定量的介质ABTS〔0.5ml〕,在不同温度30℃和pH下,每隔半个小时记录染料在特征波长处的吸光值A,相同试验条件下,加入等量灭活酶液〔100℃加热10min〕作为对照,三个重复，取平均值。
测定吸光值为A0,
脱色率〔%〕=〔A0–A1〕/A0
7结果记录及分析
硫酸铵分级盐析别离粗酶
表5硫酸铵分级盐析别离粗酶酶活
样品
发酵液
一级沉淀
上清液
一级沉淀
粗酶液
二级沉淀
上清液
二级沉淀
粗酶液
酶活〔U/mL〕
表6凝胶过柱层析收集管
实验
结果
收集管数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A280nm
酶活〔U/ml〕
实验
结果
收集管数
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
A280nm
酶活〔U/ml〕
实验
结果
收集管数
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
A280nm
酶活〔U/ml〕
图1蛋白含量曲线
图2酶活曲线
结果
图3电泳照片
纯化步骤
总体积〔mL〕
酶活〔U/mL〕
蛋白含量〔mg/mL〕
活力回收〔%〕
比活力〔U/mL〕
纯化倍数
发酵液
硫酸铵二级沉淀
SephadexG-75
酶的种类
AO1
AO2
AO3
AO4
A1
脱色率
发酵液
一级沉淀粗酶液
二级沉淀粗酶液
过柱后纯化酶液
8注意事项
〔1〕粗酶液要培养11天左右，以保证其到达酶活最高。
〔2〕提前做好实验准备。
9费用预算
除试剂外，无额外支出。
参考文献
甄永苏邵荣光主编《抗体工程药物》 2002 95
王志新等白腐真菌SYBC2L2漆酶的别离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用
黄乾明漆酶高产菌株的诱变选育及其酶的别离纯化_性质和基因克隆研究
〔生物化学与分子生物学实验技术教程赵亚华183〕
〔ShinKS，LeeYJ，PurificationandcharacterizationofanewmemberofthelaceaseFamilyfromthewhite-rotbasidiomyceteCoriolushirsutus.ArchBiochemBipohys，2000，384〔l〕:
109一115〕
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