常见的生物化学与分子生物学实验.docx
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常见的生物化学与分子生物学实验
一动物组织蛋白质得提取
【目得要求】1掌握动物组织蛋白质得提取方法。
2了解动物组织蛋白质提取得原理。
【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上得差异很大,即或就是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同得体系中,因此不可能有一个固定得程序适用各类蛋白质得分离。
但多数分离工作中得关键部分基本手段还就是共同得,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合得蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质.蛋白质在不同溶剂中溶解度得差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团得比例,其次取决于这些基团得排列与偶极矩。
故分子结构性质就是不同蛋白质溶解差异得内因.温度、ｐH、离子强度等就是影响蛋白质溶解度得外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要得物质分开。
但动物材料中得蛋白质有些以可溶性得形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离.蛋白质中得角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当得溶剂洗去可溶性得伴随物，如脂类、糖类以及其她可溶性蛋白质,最后剩下得就就是不溶性蛋白质.蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物即得粗提取液。
【试剂器材】1实验小鼠20、9ＮaCｌ3动物组织蛋白裂解缓冲液Ｔris50ｍＭ，ＮａC1150mM，ＥＤTA０、5mM，DTT1mM,TriｔoｎＸ—1001,去氧胆酸钠０、5,SDＳ0、14，PＭSF/异丙醇储备液100mM，174mg／1０mｌ于—20℃储存5－2０℃储存得冰块。
【操作步骤】1、颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取０、６g置于含预冷0、９NａＣ16mＬ得平皿中。
２、在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。
3、在预冷得裂解缓冲液中添加PMＳF／异丙醇储备液20?
Ｌ／2mＬ。
4、迅速将2mL预冷得裂解缓冲液加入匀浆器中冰浴条件下充分研磨。
5、将组织研磨液转移到1、5mL得离心管中于4℃离心１４００0rpmｌ０ｍin。
2
６、离心完毕吸取上清液转移至一新得1、5ml离心管中即为组织蛋白粗提取液。
7、所获蛋白提取液可保存于-２0℃用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。
【注意事项】
在整个制备过程中使组织始终处于冰浴状态以防蛋白质得降解。
实验二蛋白质得定量Braｄforｄ法
【目得要求】掌握考马斯亮蓝CｏomassieBrilliaｎｔＢｌｕe法测定蛋白质含量得原理与方法。
【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度就是利用蛋白质与染料结合得原理定量测定微量蛋白质浓度具有快速、灵敏得特点.考马斯亮蓝G—25０存在两种不同得颜色形式红色与蓝色。
当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。
蛋白质与G25０得结合就是通过范德华力实现得，并且在一定浓度范围内二者得结合显色符合朗伯-比尔定律。
结合后得产物在5９5nm处具有最大吸收峰,通过对溶液得光吸收测定，可获得与其结合蛋白质得量。
【试剂器材】1、考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-2５０1０0mg溶于25ｍL甲醇中加入８00mL蒸馏水再加入100ｍＬ85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mＬ滤纸过滤。
2、标准蛋白质溶液1mｇ/mＬ牛血清白蛋白1０0ｍg加0、９NaCｌ至100mＬ。
3、试管及试管架吸管。
4、比色计.
【操作步骤】一、标准曲线得制备取5支试管编号按下表操作编号1号液、２号液、3号液、4号液、5号液、标准蛋白质溶液、0mL、０、2０、40、60、81、01mg/ｍＬ、0、9NａClmL、0、80、60、40、2蛋白质浓度2０0、400、600、800、1000ug/ｍL。
另取6支试管编号为0５按下表操作编号012345,1号液2号液3号液4号液5号液不同浓度蛋白质溶液mL0、10、10、10、１0、1０、9NaＣIｍL0、1考马斯亮蓝试剂mＬ555555蛋白质含量ug0３混匀各管室温下静置10分钟,于59５nm处进行比色。
二、绘制标准曲线以A595ｎｍ为纵坐标,标准蛋白质含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。
三、测定未知样品蛋白质浓度测定方法同上取适量未知样品使其测定值在标准曲线得直线范围内。
根据所测定得Ａ595nｍ值在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质得量从而计算出未知样品得蛋白质浓度。
【注意事项】1在考马斯亮蓝试剂加入后得520分钟内测定光吸收因为在此段时间内颜色最稳定。
2测定中蛋白一染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上实验证明此复合物得吸附量就是可以忽略得测定后可用乙醇将比色杯洗干净。
实验三ＳＤS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
【目得要求】1、了解并掌握SＤS—ＰＡGE电泳原理及方法。
2、掌握垂直板电泳得操作方法。
【实验原理】十二烷基硫酸钠SＤS－聚丙烯酰胺凝胶PＡGＥ电泳,可根据蛋白质分子大小得差别分离蛋白质，并可测定蛋白质得相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在得特殊物理效应有关
１凝胶得分子筛效应，聚丙烯酰胺凝胶就是在催化剂得作用下聚合而成得具有网状立体结构得微孔凝胶蛋白质颗粒，在电场中通过此凝胶时会受到阻碍.大分子蛋白质受到得阻力大,电泳速度小,而小分子蛋白质受到得阻力小，移动快。
因而最终在凝胶中得以分离。
2电荷效应，ＳＤS就是一种表面活性剂，在蛋白样品与ＰAGE凝胶中加入SＤS则能与蛋白质分子上得疏水基团结合,使蛋白质表面覆盖一层SＤS分子。
由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有得带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身得电荷差别,使各种SＤS－蛋白质复合物都带有均等密度得负电荷,分子之间得电荷差异消失。
３变性效应，SDS同时还破坏了蛋白质中得非共价键，导致蛋白质变性，使SＤS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似得形状。
因此蛋白质在SDS—PAGE凝胶中得电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷与形状得影响,而主要取决于分子量得大小.在进行ＳＤS—PAＧE电泳时同时使用蛋白质分子量标准样品,则可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质得相对分子量。
４凝胶对样品得浓缩效应SDS—PAGE使用一种不连续得缓冲系统即分为低浓度得浓缩胶与较高浓度得分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液得pH值与离子强度也不相同。
电泳时样品中得SDS—蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大得浓缩,然后再经过分离胶被分离.SＤＳ－PAGＥ凝胶已经成为实验室常用得蛋白质分离方法,通常被用于蛋白质制品纯度得鉴定与蛋白质分子量得测定.
【试剂器材】
1，3０凝胶贮备液,称取30g丙烯酰胺与NNV-亚甲双丙烯酰胺0、8ｇ,用去离子水配制成1００ｍｌ得溶液，过滤贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2，10凝胶贮备液,称取10g丙烯酰胺与NN'-亚甲双丙烯酰胺0、5g,用去离子水配制成1００ml得溶液,过滤贮存于棕色瓶中4℃冰箱保存。
3,10ＳDS用去离子水配制贮存于室温中.
4，１ＴEMED,NNＮ’N＇-四甲基乙二胺.5，1０过硫酸铵用去离子水在临用前配制。
６,Tris—甘氨酸电泳缓冲液ｐＨ8、3Tｒis 6、0g甘氨酸28、8ｇ10SＤＳ溶液10ml用蒸馏水定容至10０0ml。
7,1、5mｏl／LpH8、8Tris－HC1缓冲液称取Ｔris1。
8,1、５g加适量蒸馏水溶解用浓HCI调节pH值至8、８,加蒸馏水至100０ml.0、5mol/Ｌ、pH6、8Tｒiｓ—HC１缓冲液，称取Trｉｓ60、6ｇ加500ml蒸馏水溶解用浓HCl调节ｐH值至6、8加蒸馏水至1000ｍｌ.
９，０、０5ｍol/ＬpH８、0Ｔris—HCl缓冲液称取Ｔｒｉs ６、１g加5００ｍｌ蒸馏水溶解用浓ＨＣl调节pH值至8、0加蒸馏水至1000ml.
10,2样品缓冲液蔗糖4g溴酚蓝2ｍｇ１０SDS溶液2ｍｌ5β巯基乙醇0、5ml0、05ｍol/LＴrｉs-ＨCｌpH8、02mｌ用蒸馏水定容至10、0ml
11,０、2５考马斯亮蓝Ｒ２50将2、5g考马斯亮蓝Ｒ250溶解于4５０ml甲醇中再加入４5０ml蒸馏水与1０0mｌ冰乙酸混匀过滤除去颗粒物质。
12，洗脱液将50ml甲醇与7５ｍl冰乙酸溶解于8７5ml蒸馏水中混匀。
13，预染蛋白质分子量标准：
１17kＤ、９０kD、4９ｋD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质
1４,电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。
【操作步骤】
1制备凝胶1准备玻璃板洗净、晾干。
按电泳槽使用说明装好按下表配制1２分离胶溶液5与5浓缩胶溶液表3-1浓缩胶与分离胶得配制溶液成分1２分离胶溶液ml５浓缩胶溶液ml30凝胶贮备液４、０1０凝胶贮备液2、51、5moｌ／LｐH8、8Tris—HＣ12、5，0、5ｍo／LpH6、8Tris-HＣl１、２5,10SＤS 0、１,0、０51TEMED0、８，0、４蒸馏水2、５0、7510过硫酸铵０、10、０5总体积1０、0５、０2小心将分离胶注入准备好得玻璃间隙中并为浓缩胶留有空间。
轻轻在顶层加入几毫升去离子水以阻止空气中得氧对凝胶聚合得抑制作用。
3凝胶聚合后倒掉上层水用滤纸吸干凝胶顶端得水.４按表3—1配制浓缩胶注入分离胶上端插入梳子应小心避免产生气泡。
2点样1待测蛋白样品得制备若样品为水溶液且蛋白质含量大于１0mg/mｌ可将待测液与样品缓冲液等体积混匀１00℃加热3min.
2浓缩胶聚合后拔去梳子将凝胶放入电泳槽中在上、下槽中加入电泳缓冲液。
３将样品混合液、标准蛋白按次序加入梳孔中。
3电泳起始电压为8Ｖ/cm当染料进入分离胶后将电压调至15Ｖ/cm继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部关闭电源。
4染色取下凝胶将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中在摇床上室温缓慢摇动30－6０ｍiｎ.
５脱色换洗脱液于摇床上室温缓慢摇动１2小时其间更换1２次洗脱液。
洗脱后得凝胶可以照像或干燥也可置于含有２0甘油得水中密闭保存。
【注意事项】
1SDS—PＡGＥ电泳要求样品得离子强度尽量要低如果离子强度过高应经透析或离子交换除盐后再进行电泳。
2丙烯酰胺试剂就是一种神经毒素可通过皮肤吸收会因多次积蓄而中毒。
操作时应极其小心需要带一次性手套。
3上样量以1015ul为宜如果样品蛋白含量过少为保证区带清晰可增加上样量６同时应将样品缓冲液浓度提高二倍或更高。
4溴酚蓝染料就是指示剂为电泳时可见得迁移标志物.
5凝胶聚合得时间与温度有关夏天聚合快可置于冰浴中减慢聚合冬天室温低可放入温箱中加快聚合。
实验四蛋白质转印实验半干式
【目得要求】1掌握半干式蛋白质转印技术得基本操作。
2掌握蛋白质转印后得检测方法。
【实验原理】蛋白质印迹Weｓｔerｎblotting就是将蛋白质电泳分离技术与免疫标记技术结合所形成得一种鉴定特异性抗原得方法。
蛋白质转印应先将含某抗原得蛋白混合物进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶ＳＤS—PAGE电泳使各种蛋白成分根据分子量得不同分离开来再通过电转移将各种蛋白成分转印到硝酸纤维素膜NC或PVDF膜上通过特异试剂抗体作为探针与膜上得相应抗原发生结合再与酶标记得抗Ｉg抗体结合洗涤后加入底物进行显色。
根据显色条带得位置与深浅可以对抗原及其分子量或相对含量进行检测.蛋白质得Ｗｅｓterｎ印迹技术结合了凝胶电泳得高分辨率与固相免疫测定得特异敏感等多种优点可检测到低至１—５ng得靶蛋白。
本实验得主要目得就是采用半干式电转移将SDS—ＰAＧE凝胶电泳分离后得蛋白质从凝胶转移至固相支持材料上.裁剪与凝胶一样大小得硝酸纤维素膜用去离子水浸湿后再浸入转移缓冲液内随后取出进行转移半干式电转移在室温操作所需时间较短将凝胶及与之相贴得硝酸纤维素膜夹于事先用转移缓冲液浸泡过得滤纸之间平放在电转仪上负极在上正极在下凝胶在阴极端薄膜在阳极端转移方向从阴极到阳极根据凝胶面积设置电流室温下进行转移转移结束取出薄膜丽春红染色检测转印效果.
【试剂器材】１半干式电泳转印槽2硝酸纤维素膜３滤纸４转移电泳仪５培养皿6万向旋转摇床７转印缓冲液
【操作步骤】1将电泳后得SDＳ-PＡGE凝胶浸在转印缓冲液中洗１0ｍin。
2去掉浓缩胶测量剩余胶得尺寸大小。
3剪1张与胶大小一致得硝酸纤维素膜,用铅笔在膜得右下角做一个标记用于定位。
剪6张与胶大小一致得滤纸，尺寸一定不能大于胶得尺寸,否则多出得部分会在胶得边缘接触形成短路导致转移不充分.
4将膜及滤纸在转印缓冲液中浸润10min。
5将3张湿滤纸放到半干电转仪得底部平板电极上负极,然后依次放置胶、硝酸纤维素膜、滤纸3张注意堆放整齐同时注意每层之间避免气泡存在,一般可用试管碾压赶走气泡，注意一旦胶与膜接触位于胶表面得蛋白就会结合到膜上,所以胶一定要一次成功，不要试图调整胶得位置,否则蛋白质色带可能会印上去最后产生重迭影像.
6待所有得膜与胶都放好后,盖上转印仪得上盖，让上部得平板电极压紧由滤纸、膜、胶形成得三明治结构,注意正负极，转印结束后才可以打开上盖。
7连接转移电泳仪电流通常设为1mA/cｍ2左右。
8cmＸ7cｍ得胶通常使用100mA恒流转移。
大胶必须限制电流在0、8mA/cm2防止电流过大产生过多热量影响转印。
转印时间如下表所示。
８转印结束取出转印三明治打开后依次取出转印膜及凝胶.
９将转印膜浸入丽春红染色液中观察就是否有红色蛋白条带出现转印后得凝胶可以进行考马斯亮蓝染色瞧有无蛋白质残留若电泳时加有预染标准蛋白质ｍａrker则可在转印膜上瞧到相应色带帮助确定转印成功并可评估转印效率。
1０若继续进行免疫杂交实验则用去离子水漂洗转印膜后可进行封闭。
【注意事项】1、不要切去胶得一角以作标记因为这样容易导致短路或转移不充分。
尽可能在电泳结束后就进行转印防止样品在胶内弥散开来。
2、丙烯酰胺浓度越低蛋白越容易转移下来.所以应选择可以分离蛋白最低浓度得凝胶进行电泳.梯度胶适用于转印一系列不同大小得蛋白因为凝胶得孔与不同大小得蛋白匹配良好。
３、蛋白质结合到硝酸纤维素膜上主要就是通过疏水键对于常规使用效果非常好。
但对于小得多肽建议使用小孔径0、2um得膜。
表4-１转印时间与蛋白分子量得关系分子量MW转印时间1ｔ20kDa3０分钟20kDa８０kＤａ６０分钟gｔ８0ｋDa９０分钟以8Ｘ7cm得迷您胶在1０0mA恒流得条件为例８
4、PVDF膜比硝酸纤维素膜更疏水在转印过程中结合蛋白更紧密可以耐受更多得ＳＤＳ。
目前PVDF膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨得封闭条件适用于蛋白测序。
尼龙膜通过疏水与静电相互作用结合其ＳDS耐受度甚至高于PVDF膜但也需要更严谨得封闭条件主要建议用于Noｒthern与Ｓoutｈeｒn杂交。
实验五 质粒DＮＡ得提取碱裂解法
【目得要求】1掌握碱裂解法制备质粒DＮＡ得原理与方法进一步认识质粒DNA得性质。
2初步掌握分子克隆基本操作技术。
【实验原理】质粒plaｓmｉd就是能在染色体外自我复制得稳定共生型遗传单位主要存在于细菌、放线菌、真菌与某些动植物细胞中。
它能在细菌中垂直遗传且保持稳定得拷贝数赋予宿主细胞某些特殊得表型。
迄今为止从细菌中分离得到得质粒都就是双链闭合环状DNA分子大小为1kb20０kb。
在基因工程研究中质粒就是最常用得一种基因克隆载体用于运载外源基因进入宿主细胞。
因此质粒DＮA得提取与纯化就是分子生物学技术中得一项基础工作。
质粒DＮA提取得关键就是要与细菌染色质DNA分开。
常用得提取方法有煮沸法、碱裂解法、去污剂法、有机溶剂法与溶菌酶法等不同方法各有利弊应根据不同质粒得性质、不同宿主菌得特性及后继得纯化方法等多种因素综合加以选择。
一般以碱裂解法最为常用因为它对细菌得裂解完全对染色质ＤNＡ与蛋白质得变性充分因而所提取得质粒DＮA产量高、纯度高。
但如果碱变性时间过长有可能会导致质粒DNA变性导致随后得内切酶酶切困难.
碱裂解法提取质粒DNＡ得主要原理与步骤就是
1接种含质粒得单个菌落到培养基中过夜培养.随着细菌得生长质粒DNA也随之自主复制。
必要时可以在细菌生长后期在培养基中适量加入氯霉素以抑制宿主细胞得蛋白质合成与染色质DNA得复制细菌得数量不再增加而质粒DNA得复制基本不受影响从而大量扩增质粒DNＡ得拷贝数.
2离心收集细菌。
3加入强碱溶液裂解菌体必要时可以适量加入溶菌酶。
此时大分子量线状得细菌染色质DNＡ与蛋白质发生变性而闭合环状得质粒DＮA多数仍不变性处于自然状态。
4几分钟后加入中与液将pＨ值调至中性。
在高盐浓度条件下大部分染色质DNA与蛋白质不能复性交连成不溶性网状结构在去污剂ＳDS得作用下形成絮状沉淀.而质粒DNA分子量小且为闭合环状结构少数变性得质粒DNA也能够迅速复性呈溶解状态。
９
5离心去除大部分细胞碎片、染色质DNA、RＮA与蛋白质。
质粒DNA保留在上清中。
6最后再用RNＡ酶消化酚／氯仿抽提、透析与乙醇或异丙醇沉淀等方法进一步去除残余蛋白质与核酸纯化质粒DＮA。
【试剂器材】1LＢ培养基蛋白胨１0ｇ酵母抽提液5gNaCl10ｇ加蒸馏水至１０００mL用NaOH调ｐH至7、５高压蒸汽消毒20mｉn。
２I号液５0mmｏｌ／L葡萄糖2５mmｏl/LＴris—ClpＨ8、０10mmoｌ/LEDＴA必要时在使用前加溶菌酶4mg/ｍＬ3IⅡ号液0、２ｍｏl／ＬＮａOH含1SDSII号液必须在实验时新鲜配制４I号液5mｏl/LKAc６0ｍｌ冰醋酸11、5ｍｌ水2８、5ml含3mｏl/L钾5mol/L醋酸ｐH4、85RNａｓe１０mg／mL2０℃保存备用6TE1０ｍmoｌ/ＬTrisHCIpH８、01ｍｍol/L EDTApH８、0。
高压灭菌2０min4℃保存备用。
7ＳTE０、1ｍｏｌ／LNａC１10mｍｏl／ＬTriｓCl pH8、０1mｍｏl／LEDTA8酚／氯仿/异戊醇2524１9乙醇无水乙醇、70乙醇-20℃保存备用10台式低温高速离心机11涡旋混合器Voｒtex１２１、5mleppenｄｏrf离心管灭菌１3移液器
【操作步骤】
1培养在5ml含适当抗生素得LB培养液中接种含质粒得单个菌落3７℃１50rpｍ振荡培养过夜。
2收菌取１—１、5ｍｌ培养液于1、５ml Eｐenｄorf管中5000rpm离心3分钟弃上清收集细菌。
3重悬弃上清在沉淀中加入预冷得I号液1０0ulvorteｘ强烈振荡充分悬浮菌体。
4裂解加新鲜配制得Ⅱ号液200uｌ立即温与颠倒离心管5次混匀.置冰水浴中3—5分钟.
５中与加入150ｕｌ预冷得Ⅲ号液立即温与颠倒混匀数次混匀。
置冰水浴中3-5分钟。
6沉淀１2000ｒpm离心1０分钟取上清液置新Ｅｐendｏrf管中。
7酚/氯仿抽提加入等体积得酚／氯仿/异戊醇25２41振荡混匀１２０0０rpm离心２分钟。
取上清液小心不要吸到中间蛋白膜转入另一个Ｅppendorｆ管中。
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8氯仿抽提加入等体积得氯仿振荡混匀1２０00rｐm离心２分钟取上清液转入另一个Eppｅndorf管中。
9乙醇沉淀加入2倍体积得无水乙醇或０、６倍体积异丙醇混匀室温放置１０分钟。
4℃120０0rpm离心５分钟。
10洗涤弃上清沉淀用7０乙醇洗涤4℃12０00rｐm离心2分钟.
11干燥弃上清用消毒滤纸条小心吸净管壁乙醇滴。
将Ｅｐpｅndoｒf管倒置于滤纸上室温蒸发乙醇１0分钟。
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