无菌检查方法验证方案.docx
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无菌检查方法验证方案
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安徽捷众生物化学有限公司
无菌检查方法（薄膜过滤法）
验证方案
文件编号：
QY·TS·05·007-00
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批准日期：
年月日实施日期年月日
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安徽捷众生物化学有限公司表批文件审
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案文件名称：
-00QY·TS·05·007文件编号：
/QC文件提出部门：
质量控制部
□新订修订□文件起草目的：
√
日年月文件起草人（签字）：
完成日期：
文件会审部门
文件审核人（签字）
期审核日
质量管理部
日月年
质量保证部/QA
日月年
/QC
质量控制部
日月年
生产部
日月年
（工程设备）部
日年月
日年月文件批准人（签字）：
批准日期
施实月日起文件实施日期：
年
文件编制依据：
2010年修订版和修订附录1、卫生部：
《药品生产质量管理规范》年版附录。
、《中华人民共和国药典》2（二部）2010
校对人：
文件复制人：
月日复制份数：
复制日期：
年
颁发部门：
质量管理部
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分发单位：
备注：
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安徽捷众生物化学有限公司
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案
1．验证目的
2.验证频次
3.验证操作内容与要求
3.1.验证操作试验3.2试验菌要求验证方法步骤3.3.验证准备3.4.
3.5验证试验操作．验证结果评价分析4．附件5
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安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案
编号
QY·TS·05·007-00
页数
11共页
制定人
制定日期
年月日
修订日期
日年月
审核人
审核日期
月年日
颁发部门
质量管理部
批准人
批准日期
年月日
生效日期
日年月
分发部门
相关部门
．验证目的1确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。
即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
验证频次2.
建立药品的无菌检查法时2.1.
修订检验方法时2.2.
2.3.供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时3.验证操作内容与要求：
3.1.验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证操作试验：
对每一试验菌应逐一进行验证。
3.1.1.
硫乙醇酸盐流体培养基—金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生3.1.2.
孢梭菌。
3.1.3.改良马丁琼脂培养基—白色念珠菌、黑曲霉。
试验菌要求：
3.2
代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保验证试验所用的菌株传代次数不得超过3.2.15证试验菌株的生物学特性。
验证试验可在供试品的无菌检查之前或与供试品的无菌检查同时进行。
当同时进3.2.2.
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行时，若验证试验失败，则供试品的无菌检查结果是不成立的
3.3验证方法步骤：
.3.31验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照无菌检查方法（薄膜过滤法）进.行平行试验，通过计算回收率来判断无菌检查方法（薄膜过滤法）是否对产品有影响。
3.32试验结果可接受标准用无菌标准评价方法“0.9％氯化钠注射液（三层共挤膜.袋）的无菌检查”对检品中无菌检查试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。
3.4.验证准备：
准备验证所需的供试品、培养基、试药试剂、仪器设备和菌种。
3.4.1.培养基
硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁琼脂培养基；营养琼脂培养基；血琼脂培养基
备注：
3.4.1.1培养基应注明来源；如采用市售干粉培养基，应按说明配制。
3.4.1.2配制后的培养基应按照中国药典附录“无菌检查法”中“培养基的适用性检查”项下检验无菌性和灵敏度。
3.4.2仪器设备
3.4.2.1.净化工作台
3.4.2.2.生物洁净安全柜
3.4.2.3.集菌仪
3.4.2.4.生化培养箱
3.4.2.5.霉菌培养箱
3.4.2.6.高温试验箱
3.4.2.7.台式灭菌器
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3.4.2.8.医药品冷藏柜
3.4.2.9.微波炉
3.4.2.10.器具无菌培养皿：
（直径90mm）无菌移液管（5ml）等
备注：
以上仪器设备需要确认与验证的均应已按要求验证。
3.4.3.菌种
3.4.3.1.金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕
3.4.3.2.枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63501〕
3.4.3.3.白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕
3.4.3.4.黑曲霉〔CMCC（F）98003〕
3.4.3.5.铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10104〕
3.4.3.6.生孢梭菌〔CMCC（B）64941〕
3.4.4操作环境：
3.4.4.1操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。
3.4.4.2环境洁净度不应低于C级，净化工作台洁净度为A级。
3.4.4.3操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于10pa。
3.4.5试验样品：
0.9％氯化钠注射液（三层共挤膜袋）规格：
250ml
①批号：
生产日期：
②批号：
生产日期：
③批号：
生产日期：
3.4.6稀释液和试剂：
PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌十四烷酸异丙酯
3.4.7验证用微生物名称及其编号
3.4.7.1实验菌株的来源：
.
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序号
菌株名称
菌株代码及编号
内控编号
1
金黄色葡萄球菌
B）26003〕〔CMCC（
2
铜绿假单胞菌
）10104〕〔CMCC（B
3
枯草芽孢杆菌
〕〔CMCC（B）63501
4
白色念珠菌
）〔CMCC（F98001〕
5
生孢梭菌
〕（B）64941〔CMCC
6
黑曲霉
）98003〕〔CMCC（F
编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成3.4.7.2培养基3.4.8
名称
生产商
培养基批号
配制日期
有效期
营养琼脂培养基
改良马丁琼脂培养基
验证试验操作：
3.53.5.1试验菌的制备和稀释：
℃3530将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在～3.5.1.1℃下培养28～小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，下培养18～242324～48小时。
528233.5.1.2将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在～℃下培养～7天小时。
的含菌落数为1ml的无菌氯化钠溶液制成每将上述培养物用3.5.1.30.9%50100cfu～菌悬液。
.
.
3.5.2用不同类别的微生物考察供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组
3.5.2.1样品试验组：
A准确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。
B然后加入45℃的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：
10的供试液。
C用移液管准确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50～100cfu试验菌，立即倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，按照平皿法测定其菌数。
3.5.2.2菌液组：
按中国药典附录“无菌检查法”中“灵敏度检查”项下的菌液制备
A在平皿中注入1ml的菌液立即倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。
B供试品对照组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。
C稀释剂对照组取相应稀释液1ml加入试验菌，使最终菌浓度为每ml供试液含50～100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。
D对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的试验人员的测定结果可能有很大的误差。
所以在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。
E当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体分散于稀释液中。
F为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。
G液体培养物直接稀释法较比浊法造成误差小，基本保证每次菌数能控制在要求的范围内。
.
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I最终制得的菌悬液应为小于100CFU/ml。
J金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌采用营养琼脂培养基；生孢梭菌采用血琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉采用改良马丁琼脂培养基。
3.5.3培养将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在30～50℃下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培养72小时，点计菌落数。
并将结果记录于附件1。
3.5.4试验结果
3.5.4.1稀释剂对照组菌的回收率
接入菌种
％氯化钠注射液0.9批号
菌落计数（cfu/皿）
回收率
稀释剂对照组
菌液组
金黄色葡萄球平均值
铜绿假单胞菌平均值
枯草芽孢杆菌平均值
白色念珠菌
.
.
平均值
生孢梭菌平均值
黑曲霉平均值
100%。
表中：
回收率=稀释剂对照组的平均菌落数÷菌液组的平均菌落数×3.5.4.2试验组的菌的回收率
接入菌种
％氯化钠注射液0.9批号
皿）菌落计数（cfu/
回收率
试验组
供试品对照组
金黄色葡萄球平均值
铜绿假单胞菌平均值
枯草芽孢杆菌
.
.
平均值
白色念珠菌平均值
生孢梭菌平均值
黑曲霉平均值
（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数的值）÷菌液组的平=表中：
回收率。
均菌落数×100%．验证结果评价分析4对验证结果的评审应包括：
4.1验证试验是否有遗漏？
（1）依据以及是否经过批准？
）2验证实施过程中对验证方案有无修改？
修改原因、（）验证记录是否完整？
（34（）验证试验结果是否符合标准要求？
偏差及对偏差的说明合理？
是否
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