发酵工程实验方案.docx

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发酵工程实验方案

生物发酵工程实验

实验一................................利用酵母富集培养基分离酵母菌

实验二............................分离纯化酵母菌

实验三............................酵母菌的保藏

实验四...............................大肠杆菌生长曲线测定及pH对生长曲线的影响

实验五..............................发酵罐的构造及操作

实验六..............................发酵罐实灌灭菌操作

实验七..............................利用7L发酵罐对地衣芽孢杆菌进行补

料分批发酵培养

实验八..............................淀粉酶生成曲线的测定

实验一、利用酵母富集培养基分离酵母菌

一实验目的

1、通过本实验加深理解酵母富集培养基的原理和应用；

2、掌握涂布分离技术；

3、熟悉从自然样品土壤中分离酵母菌的具体操作方法

二实验原理

酵母菌主要分布于含糖高和酸度较高的自然环境中，在果园表土和浆果、蔬菜、花蜜和蜜饯等的表面很容易找到它们。

在土壤中，由于各种微生物混杂在一起且酵母菌的数量相对比较少，故可以利用酵母菌富集培养基进行富集培养，该培养基含有较高的葡萄糖（5%）和较酸（pH为4.5）的环境，以及能抑制多种杂菌（许多细菌、放线菌和快速生长霉菌）的孟加拉红（玫瑰红），故十分有利于酵母菌的增值。

三实验材料

土壤（标注采集地点）

培养基：

酵母富集培养基（5%葡萄糖、0.1%尿素、0.1%硫化铵、0.25%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钠、0.1%七水合硫酸镁、0.01%七水合硫酸铁、0.05%酵母膏、0.003%孟加拉红、1.9%琼脂pH4.5）

移液枪、培养皿、天平、涂布棒、棉绳、250ml三角瓶、75%酒精棉花、摇床等

四实验步骤

1、采集土样：

采集葡萄园或其他果园、菜地等的土壤若干（要求：

先铲去2~3cm的表土，再采集土样）适当研碎。

2、称取1g土样装入准备好的30/250ml蒸馏水中震荡均匀。

3、准备平板：

将酵母菌富集培养基加热融化，待冷却至50℃左右后，倒2个平板，冷却待用。

4、用移液枪吸取200ul样品，用涂布法分离菌种。

5、恒温培养：

将培养皿倒置后防于37℃恒温培养箱中培养2d。

五结果记录

将土壤来源，平板上得到的菌落特征和菌落数做表记录

六思考题

酵母菌富集培养基中为什么要加孟加拉红

实验二分离纯化酵母菌

一实验目的

1、通过本实验学习掌握对菌种纯化及保种的操作；

二实验原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。

在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

三实验材料

培养基：

PDA培养基

材料：

接种环、试管斜面、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱等

四实验步骤

1、观察前一次实验平板，找出符合条件的菌落。

2、在超净工作台中用接种环挑取单菌落一环在平板上画Z字型线条

3、将平板贴好标签后置于37℃恒温培养箱中培养2d。

五结果记录

记录纯化斜面后的菌落形态

六思考题

选取菌落时要考虑到那些因素及其原因。

实验三酵母菌的保藏

实验目的

1、掌握细菌的一般保藏原理和方法

2、掌握甘油保种技术；

3、了解菌种衰退的原理

实验原理

菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。

菌种在传代过程中，原有的生产性状会逐渐下降，这就是菌种的衰退。

衰退由菌株的自发突变引起，一旦发现衰退，就必须立即进行复壮。

所谓复壮，就是通过纯种分离和性能测定等方法从衰退的群体中找到为衰退的个体，已达到回复该菌株原有形状的一种措施。

要防止衰退，关键是做好菌种的保藏工作，即创造一定的物理和化学条件，如低温、干燥、缺氧气或缺养料等，来降低微生物细胞内酶的活性，使微生物代谢作用缓慢，甚至处于休眠状态。

所以保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。

对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的

三实验材料

培养基：

PDA培养基

材料：

30%甘油、接种环、试管斜面、酒精灯、超净工作台、、移液管、1ml移液枪、5ml移液枪、1ml/5ml枪头、恒温培养箱等

四实验步骤

5、菌种保藏

一、斜面低温保藏法：

此法为最常用的一种。

一般霉菌；放线菌和有芽孢的细菌可保存2～4个月，酵母菌可保存2个月，无芽孢的细菌最好每周移接一次。

操作过程如下：

保藏：

选取生长健壮的菌种，于其试管带棉塞的上半部用灭菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染杂菌。

置于4℃冰箱中保藏。

二、液体石腊保藏法：

此法可用不分解石腊的菌种保藏。

保存时间是半年至一年。

放线菌；霉菌和产芽孢菌可保藏二年。

液体石腊可防止培养基水分的蒸发，而引起的菌种死亡。

同时可阻止氧气进入，防止好氧菌的生长。

从而延长菌种保藏的时间。

但需注意的是试管必须直立放置，并且不便携带。

操作过程如下：

1、液体石腊的灭菌：

将液体石腊装入锥形瓶中，量不超出锥形瓶体积的1/3，塞上棉塞，包扎好后，进行高压蒸汽灭菌二次（120℃30分钟）。

再在110～120℃干燥箱中蒸发掉蒸汽灭菌时带入的水分。

此时石腊透明清亮状。

经检验确定无菌后备用。

2、菌种培养：

挑取前一次纯化的健状单菌落保藏

3、加石腊油：

用无菌管吸取石腊油加入菌种试管中，以高出菌种斜面顶点1cm为宜。

少了会因培养基露出油面，而使培养基变干造成菌死亡。

4、收藏：

试管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4℃。

5、恢复使用：

当要使用菌种时。

倾出石腊油。

此石腊油可再灭菌重复使用。

接种培养。

由于菌体外粘有油。

第一次的菌生长缓慢，性状恢复不是很好。

所以要再移植一次才能得到良好的菌种。

六思考题

除了上述两种菌种保藏方法外还有那些保藏法，其各自的优点是什么？

实验四大肠杆菌生长曲线的测定及pH对其生长曲线的影响

一、目的要求

了解大肠杆菌生长曲线的基本特征，从而认识微生物在一定条件下生长、繁殖的规律。

二、基本原理

一定量的微生物，接种在适合的新鲜液体培养基中，在适宜的温度下培养，以菌数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，做出的曲线叫生长曲线。

一般可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。

不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。

微生物在不同的pH值的环境中的生长情况也不一样，因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。

测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。

本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（OD值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。

三、器材

培养18—20小时的大肠杆菌培养液，盛有30ml肉膏蛋白胨液体培养基的250ml三角瓶；72型或72．1型分光光度计，自控水浴振荡器或摇床，无菌吸管，离心管，离心机，pH计等。

四、操作步骤

1．配制培养基和分装

配制好不同pH值（4、5、6、7、8、9、10）的肉膏蛋白胨液体培养基，分装到250ml三角瓶中，分装量为30/250ml，灭菌。

2．接种

用1ml无菌吸管，每次准确地吸取1ml大肠杆菌培养液，分别接种到已灭菌的肉膏蛋白胨液体培养基大试管中，接种后振荡，使菌体混匀。

3．培养

将接种后锥形瓶置于摇床上，37℃，180rmp/s振荡培养。

分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、20小时在无菌环境中取2ml于灭菌的离心管中，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定光密度值。

4．比浊测定

以未接种的肉膏蛋白胨培养基作空白对照，选用540—560nm波长进行光电比浊测定。

从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0．1—0．65以内，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。

五、实验报告

1．结果

（1）将测定的OD值填入自制表格。

（2）绘制大肠杆菌的生长曲线

2．思考题

（1）为什么说用比浊法测定的细菌生长只是表示细菌的相对生长状况？

（2）在生长曲线中为什么会出现稳定期和衰亡期？

在生产实践中怎样缩短延迟期？

怎样延长对数期及稳定期？

怎样控制衰亡期？

试举例说明。

实验五发酵罐的构造及操作

【实验目的】

1、熟知发酵罐的结构和管路。

2、学习空压机的使用。

3、学习蒸汽发生器的使用。

【实验原理】

按照生物反应器的类型，发酵罐可分为三大类。

（1）敞口式发酵：

属于繁殖速度快的好氧发酵，例如酵母工业；

（2）半密闭式发酵：

如酵母菌等的发酵，大多数情况下属于不是很严格的厌氧发酵；（3）密闭式发酵：

主要是好气性的液体深层培养，要求复杂，但无菌程度高。

发酵罐的主要部件包括以下几部分。

罐体：

主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好（防止菌体被污染）；罐体当中有搅拌浆，用于发酵过程当中不停的搅拌；空气处理系统，用来供给菌体生长所需要的空气或氧气；蒸汽净化系统以供给发酵罐空消及实效所需蒸汽；罐体上有控制传感器，最常用的有pH电极和容氧电极，用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化。

此外有些发酵罐还配备有电气控制系统，用来显示和控制发酵条件等等。

【实验材料】

保兴Bio-tech2002发酵罐，空气发生器，空气压缩机。

【实验内容】

1．认识发酵系统的构造，以及各个部分的功能：

（1）构造：

发酵系统由三大组块构成：

空气压缩机，蒸汽发生器，自控发酵罐体

（2）空气压缩机：

用来供给菌体生长所需要的空气或氧气

蒸汽发生器：

供给发酵罐空消及实消所需蒸汽

罐体：

主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好（防止菌体被污染）；罐体当中有搅拌浆，用于发酵过程当中不停的搅拌；罐体上还有控制传感器，最常用的有pH电极和溶氧电极，用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化。

2．空气压缩机的使用

（1）接通电源，将K1调整至Auto档位。

（2）待电机自动停止加压后，压力指针指为6

（3）将调节阀F轻轻上提，旋转，调整空气压力为0.2。

（4）打开K2。

空气压缩机开启完毕。

开启完毕后，只需保证电源，在压力一切正常的条件下，不必有其他操作。

2．蒸汽发生器的使用

（1）将进水口接好蒸馏水，保证蒸馏水水位正常，连通皮管内充满蒸馏水。

（2）听到蒸馏水不再流向蒸汽发生器时，接通电源，打开电源键P。

（3）随着不断加热，一段时间后，锅炉内的温度和压力不断上升，压力上升至60kg/cm2，此时加热系统会自动关闭，压力和温度不再上升。

蒸汽发生器开启完毕。

开启完毕后，需保证电源和蒸馏水的供应即可。

3．认识发酵罐的结构，发酵罐空消的流程和具体操作步骤

（1）压缩空气经净化器（外接）进入气源接口、减压稳压器、空气流量计、空气出口进入空气过滤器到达反应器内，经特制的空气分布器分散后，进入培养基，尾气经冷凝器、排气过滤器后排口排出，本管路具有减压、计量、净化作用。

（2）自来水进盘管：

自来水经阀W3、电磁阀W4、夹套盘管进水口、夹套内置盘管、盘管水出口及冷凝水阀V1排出。

（