第八章线粒疾病的遗传.docx

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第八章线粒疾病的遗传

第八章线粒体疾病的遗传

线粒体是真核细胞的能量代谢中心，其内膜上富含呼吸链-氧化磷酸化系统的酶复合体，可通过电子传递和氧化磷酸化生成ATP，为细胞提供进行各种生命活动所需要的能量。

大量研究表明，线粒体内含有DNA和转译系统，能够独立进行复制、转录和翻译，是许多人类疾病的重要病因。

第一节人类线粒体基因组

线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）是独立于细胞核染色体外的又一基因组，被称为人类第25号染色体，遗传特点表现为非孟德尔遗传方式，又称核外遗传。

mtDNA分子量小，结构简单，进化速度快，无组织特异性，具有特殊的结构特征、遗传特征和重要功能，而且在细胞中含量丰富（几乎每个人体细胞中都含有数以百计的线粒体，一个线粒体内有2～10个拷贝的DNA），易于纯化，是研究基因结构和表达、调控的良好模型，在人类学、发育生物学、分子生物学、临床医学、法医学等领域受到广泛的重视，并取得令人瞩目的成就。

1981年，Anderson等人完成了人类线粒体基因组的全部核苷酸序列的测定。

mtDNA所含信息量小，在呼吸链-氧化磷酸化系统的80多种蛋白质亚基中，mtDNA仅编码13种，绝大部分蛋白质亚基和其他维持线粒体结构和功能的蛋白质都依赖于核DNA（nuclearDNA，nDNA）编码，在细胞质中合成后，经特定转运方式进入线粒体。

此外，mtDNA基因的表达受nDNA的制约，线粒体氧化磷酸化酶系统的组装和维护需要nDNA和mtDNA的协调，二者共同作用参与机体代谢调节。

因此线粒体是一种半自主细胞器，受线粒体基因组和核基因组两套遗传系统共同控制（图8-1），nDNA与mtDNA基因突变均可导致线粒体中蛋白质合成受阻，细胞能量代谢缺陷。

图8-1mtDNA与nDNA的协同作用

一、线粒体基因组的结构

线粒体基因组全长16569bp，不与组蛋白结合，呈裸露闭环双链状，根据其转录产物在CsCl中密度的不同分为重链和轻链，重链（H链）富含鸟嘌呤，轻链（L链）富含胞嘧啶。

mtDNA分为编码区与非编码区，编码区为保守序列，不同种系间75%的核苷酸具同源性，此区包括37个基因：

2个基因编码线粒体核糖体的rRNA（16S、12S），22个基因编码线粒体中的tRNA，可满足线粒体蛋白质翻译中所有密码子的需要，13个基因编码与线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）有关的蛋白质，其中3个为构成细胞色素c氧化酶（COX）复合体（复合体Ⅳ）催化活性中心的亚单位（COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ），这三个亚基与细菌细胞色素c氧化酶是相似的，其序列在进化过程中是高度保守的；还有2个为ATP合酶复合体（复合体Ⅴ）F0部分的2个亚基（A6和A8）；7个为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体Ⅰ）的亚基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6）；还有1个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体（复合体Ⅲ）中细胞色素b的亚基。

13个mRNA基因序列都以ATG（甲硫氨酸）为起始密码，长度均大于编码50个氨基酸多肽所必需的长度。

线粒体基因组各基因之间排列极为紧凑，部分区域还出现重叠，即前一个基因的最后一段碱基与下一个基因的第一段碱基相衔接，利用率极高。

并有终止密码结构，长度均超过可编码50个氨基酸多肽所必需的长度，无启动子和内含子，缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。

基因间隔区只有87bp，占mtDNA总长度的的0.5%。

因而，mtDNA任何区域的突变都可能导致线粒体氧化磷酸化功能的病理性改变。

mtDNA有两段非编码区，一是控制区（control-region，CR），又称D环区（displacementloopregion，D-loop），另一个是L链复制起始区。

D环区位于双链3´端，多为串联重复序列。

D环区由1122bp组成（图8-2），与mtDNA的复制及转录有关，包含H链复制的起始点（OH）、H链和L链转录的启动子（PH1、PH2、PL）以及4个保守序列（分别在213～235、299～315、346～363bp和终止区16147～16172bp）。

图8-2线粒体基因组

mtDNA突变率极高，多态现象比较普遍，两个无关个体的mtDNA中碱基变化率可达3%，尤其D环区是线粒体基因组中进化速度最快的DNA序列，极少有同源性，而且参与的碱基数目不等，其16024nt～16365nt（nt：

核苷酸）及73nt～340nt两个区域为多态性高发区，分别称为高变区Ⅰ（hypervariableregionⅠ，HVⅠ）及高变区Ⅱ（hypervariableregionⅡ，HVⅡ），这两个区域的高度多态性导致了个体间的高度差异，适用于群体遗传学研究，如生物进化、种族迁移、亲缘关系鉴定等。

二、线粒体DNA的复制

mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。

复制起始于控制区L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，合成一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。

被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。

随着新H链的合成，D环延伸，轻链复制起始点OL暴露，L链开始以被置换的亲代H链为模板沿逆时针方向复制。

当H链合成结束时，L链只合成了1/3，此时mtDNA有两个环：

一个是已完成复制的环状双链DNA，另一个是正在复制、有部分单链的DNA环。

两条链的复制全部完成后，起始点的RNA引物被切除，缺口封闭，两条子代DNA分子分离（图8-3）。

新合成的线粒体DNA是松弛型的，约需40分钟成为超螺旋状态。

图8-3D-环复制

多细胞生物中，mtDNA复制并不均一，有些mtDNA分子合成活跃，有些mtDNA分子不合成。

复制所需的各种酶由nDNA编码。

mtDNA的复制形式除D环复制外，还有θ复制、滚环复制等，相同的细胞在不同环境中可以其中任何一种方式复制，也可以几种复制方式并存，其调节机制不明。

三、线粒体基因的转录

与核基因转录比较，mtDNA的转录有以下特点：

①两条链均有编码功能：

重链编码2个rRNA、12个mRNA和14个tRNA；轻链编码1个mRNA和8个tRNA；②两条链从D-环区的启动子处同时开始以相同速率转录，L链按顺时针方向转录，H链按逆时针方向转录；③mtDNA的基因之间无终止子，因此两条链各自产生一个巨大的多顺反子初级转录产物。

H链还产生一个较短的、合成活跃的RNA转录产物，其中包含2个tRNA和2个mRNA；④tRNA基因通常位于mRNA基因和rRNA基因之间，每个tRNA基因的5′端与mRNA基因的3′端紧密相连，核酸酶准确识别初级转录产物中tRNA序列，并在tRNA两端剪切转录本，形成单基因的mRNA、tRNA和rRNA，剪切下来的mRNA无5′帽结构，在polyA聚合酶的作用下，在3′端合成一段polyA，成为成熟的mRNA。

初级转录产物中无信息的片段被很快降解；⑤mtDNA的遗传密码与nDNA不完全相同：

UGA编码色氨酸而非终止信号，AGA、AGG是终止信号而非精氨酸，AUA编码甲硫氨酸兼启动信号，而不是异亮氨酸的密码子；⑥线粒体中的tRNA兼用性较强，其反密码子严格识别密码子的前两位碱基，但第3位碱基的识别有一定的自由度（称碱基摆动），可以识别4种碱基中的任何一种，因此，1个tRNA往往可识别几个简并密码子，22个tRNA便可识别线粒体mRNA的全部密码子（表8-1）。

与nDNA比较，线粒体密码子的第3位更常见的是A或C，这是线粒体密码子简并性的主要来源。

表8-1丙氨酸（Ala）的tRNA反密码子摆动

密码子

反密码子

核tRNA

线粒体tRNA

GCU、GCC

GCA、GCG

GGC

UGC

UGC

第二节线粒体基因的突变

自从1988年发现第一个mtDNA突变以来，已发现100多个与疾病相关的点突变、200多种缺失和重排，大约60%的点突变影响tRNA，35%影响多肽链的亚单位，5%影响rRNA。

mtDNA基因突变可影响OXPHOS功能，使ATP合成减少，一旦线粒体不能提供足够的能量则可引起细胞发生退变甚至坏死，导致一些组织和器官功能的减退，出现相应的临床症状。

一、突变率

mtDNA突变率比nDNA高10～20倍，其原因有以下几点：

①mtDNA中基因排列非常紧凑，任何mtDNA的突变都可能会影响到其基因组内的某一重要功能区域；②mtDNA是裸露的分子，不与组蛋白结合，缺乏组蛋白的保护；③mtDNA位于线粒体内膜附近，直接暴露于呼吸链代谢产生的超氧离子和电子传递产生的羟自由基中，极易受氧化损伤。

如：

mtDNA链上的脱氧鸟苷（dG）可转化成羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG），导致mtDNA点突变或缺失；④mtDNA复制频率较高，复制时不对称。

亲代H链被替换下来后，长时间处于单链状态，直至子代L链合成，而单链DNA可自发脱氨基，导致点突变；⑤缺乏有效的DNA损伤修复能力。

确定一个mtDNA是否为致病性突变，有以下几个标准：

①突变发生于高度保守的序列或发生突变的位点有明显的功能重要性；②该突变可引起呼吸链缺损；③正常人群中未发现该mtDNA突变类型，在来自不同家系但有类似表型的患者中发现相同的突变；④有异质性存在，而且异质性程度与疾病严重程度正相关。

二、突变类型

mtDNA突变类型主要包括点突变、大片段重组和mtDNA数量减少。

（一）点突变

点突变发生的位置不同，所产生的效应也不同。

已知的由mtDNA突变所引起的疾病中，2/3的点突变发生在与线粒体内蛋白质翻译有关的tRNA或rRNA基因上，使tRNA和rRNA的结构异常，影响了mtDNA编码的全部多肽链的翻译过程，导致呼吸链中多种酶合成障碍；点突变发生于mRNA相关的基因上，可导致多肽链合成过程中的错义突变，进而影响氧化磷酸化相关酶的结构及活性，使细胞氧化磷酸化功能下降。

（二）大片段重组

mtDNA的大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。

大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。

最常见的缺失是8483～13459位碱基之间5.0kb的片段，该缺失约占全部缺失患者的1/3，故称“常见缺失”（commondeletion），由于A8、A6、COXⅢ、ND3、ND4L、ND4、ND5及部分tRNA基因的丢失，造成OXPHOS中某些多肽不能生成，ATP生成减少，多见于Kearns-Sayre综合症（KSS）、缺血性心脏病等；另一个较为常见的缺失是8637～16073位碱基之间7.4kb的片段，两侧有12bp的同向重复序列，丢失了A6、COXⅡ、ND3、ND4L、ND4、ND5、ND6、cytb、部分tRNA和D-环区的序列，多见于与衰老有关的退行性疾病；第三种常见的缺失是第4389至14812位10.4kb的片段，由于大部分基因丢失，能量代谢受到严重破坏。

引起mtDNA缺失的原因可能是mtDNA分子中同向重复序列的滑动复制或同源重组，典型疾病为KSS、慢性进行性眼外肌瘫痪（CPEO）等。

（三）mtDNA数量减少

mtDNA数量的减少可为常染色体显性或隐性遗传，即提示该病由核基因缺陷所致线粒体功能障碍。

三、突变的修复

过去人们认为线粒体中缺乏DNA修复系统，近年来的研究表明，线粒体有一定的自我修复能力。

mtDNA的修复机制主要有两种。

一种为切除修复：

核酸内切酶先切除损伤DNA片段，然后DNA聚合酶以未损伤链为模板，复制正确的核苷酸序列以填补形成的空缺。

线粒体内存在上述过程所需的几种酶；另一种是转移修复，通过转移酶识别突变核苷酸（如甲基化核苷酸），并将该突变核苷酸清除。

线粒体中虽然存在该修复类型所需的某些酶，但种类较少，清除突变碱基的能力远低于nDNA，而且在分裂旺盛的组织中有酶活性，在分裂终