分子生物学实验技术.docx

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分子生物学实验技术

分子生物学实验技术

一基本操作

实验一、细菌培养

实验二、质粒DNA提取

实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度

实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析

实验八、植物RNA提取及纯化

二、目的基因获取

实验七、聚合酶链 式反应（PCR）技术体外扩增DNA

实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA

三、目的基因的克隆和表达

实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应

实验十一、感受态细胞的制备及转化

实验十二、克隆的筛选和快速鉴定

实验十三、DNA分析——Southern杂交

实验一细菌的培养

一、目的

学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理

在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。

实验室中最常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器

（一）实验材料

大肠杆菌

（二）试剂

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化钠

4、1mol/LNaOH

5、琼脂粉

6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）

（三）仪器

1、培养皿

2、带帽试管

3、涂布器

4、灭菌锅

5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）

6、恒温摇床

四、操作步骤

（一）LB培养基的配制

配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：

细菌培养用胰蛋白胨10g

细菌培养用酵母提取物5g

NaCl10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/LNaOH调节pH位至7.0。

加入去离子水至总体积为lL，在15lbf／in2（1.034×105Pa）高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。

LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。

（二）细菌的培养

（１）在液体培养基中培养

1、过夜培养

取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。

用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。

盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。

２、大体积培养

按1∶100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。

于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。

（２）在固体培养基中培养细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。

平板划线法分离单菌落

采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。

重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。

于37℃培养直至长出单菌落。

实验二质粒DNA的提取

目的

学习碱裂解法提取质粒的原理

原理

质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。

它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。

目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。

现在常用的方法有：

碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。

实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。

其主要原理：

利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

试剂与器材

一、试剂

1、LB液体培养基：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5。

高压灭菌20min。

2、LB平板培养基：

在每1000mLLB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20min。

3、溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-HCl（pH8.0）。

4、溶液Ⅱ：

0.2mol/LNaOH,1%SDS。

（必须现配）

5、溶液Ⅲ：

pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL）。

6、TE缓冲液（pH8.0）：

10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA。

7、无水乙醇和70%乙醇。

二、器材

1、Eppendorf管、离心管架

2、10，100，1000ul微量加样器

3、台式高速离心机

4、摇床、高压灭菌锅

5、大肠杆菌DH5α（含质粒）

操作步骤

一、培养细菌

将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃×24h，然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃×12h。

二、提取步骤

1、将菌液移入1.5ml离心管，8000rpm×1min，倒置于滤纸上，彻底除去残液。

2、加入100ul预冷的溶液Ⅰ，用涡旋震荡器充分悬浮菌体。

3、加入4ulRNase，室温×2min。

4、加入200ul溶液Ⅱ，快速颠倒，温和混匀，冰浴5min。

此时溶液应非常粘稠。

5、加入150ul预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），冰浴5min。

6、12000rpm×5min。

转移上清液至另一1.5ml离心管中。

7、上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃×20min。

8、12000rpm×5min，彻底除去残液。

9、加入500ul70%乙醇洗DNA沉淀。

3000rpm×1min，彻底挥发除去乙醇。

10、加入40ulddH2O溶解DNA，待用。

（或用TE溶解，-20℃保存）。

实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度

一、目的

学习测定DNA或RNA的浓度与纯度。

二、原理

核酸分子中的碱基集团含有共轭双键，它们对紫外光有强烈的吸收。

核酸的最大吸收波长在260nm，吸收低峰在230nm。

可以利用核酸的这一特性对其浓度进行测定。

在波长260nm下，A260=1时，双链DNA的含量为50µg/ml，单链DNA为33µg/ml，RNA为40µg/ml，寡聚核苷酸为20～30µg/ml。

测出核酸溶液在A260的值，即可得出浓度。

根据经验数据，纯得DNAA260/A280=1.8,纯的RNAA260/A280=2.0.若样品中含有蛋白或其它杂质会使其比值下降。

三、试剂与仪器

（一）试剂

TE缓冲溶液

（二）仪器

紫外分光光度计

四、操作步骤

1、开机，选择波长

开机前应先检查光路中有无障碍物。

然后开启电源开关预热20左右。

并调节波长在260nm下。

2、选择A档，调零

面表上有4个可供选择的模式，本实验选择测定A值，因此选择A模式。

待测核酸为水或TE溶液，选择水或TE做空白对照进行调零。

3、测定样品

将待测样品做适当稀释，用仪器配套的石英比色杯，以水或TE为对照的条件下测定，读取并记录样品A260的值。

4、计算样品的浓度

双链DNA浓度=50µg/ml×A260×稀释倍数

单链DNA浓度=33µg/ml×A260×稀释倍数

单链RAN浓度=40µg/ml×A260×稀释倍数

核酸总量=样品浓度×样品体积（ml）

实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

目的

学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。

原理

水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN发射的荧光，增强几十倍。

而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。

若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。

电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。

如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。

质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。

凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。

在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。

这三种构型的分子有不同的迁移率。

在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。

当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。

在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。

增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。

同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。

试剂与器材

一、试剂

1、DNA样品

2、TBE缓冲液（5×）：

用时需稀释10倍

3、点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

0.25%溴酚蓝，40%甘油

4、溴乙啶染色液（EB）：

10mg/ml溴乙啶注意：

该试剂具致癌作用，用时要小心。

5、琼脂糖

二、器材

1、电泳仪系统

2、紫外灯

3、恒温水浴箱

操作步骤

1．选择合适的水平式电泳仪，调节电泳槽平面至水平，检测稳压电源与正负极的线路。

2．选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳槽负极的一端，使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。

3．制备琼脂糖凝胶：

按照被分离的DAN分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

一般情况下可参考下表：

琼脂糖的含量（%）

g/ml

分离线状DNA分子的有限范围（kb）

0.3

60~5

0.6

20~1

0.7

10~0.8

0.9

7~0.5

1.2

6~0.4

1.5

4~0.2

2.0

3~0.1

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，一般配制约40ml凝胶液，置微波炉中或水浴加

热，至琼脂糖融化均匀。

4．将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，在一端插好梳子。

待凝胶溶液冷却至60℃

左右时，在凝胶溶液中