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研究中文版

柚叶和根中的有机酸代谢与一氧化氮和铝相互作用的影响是不同的

摘要：

蜜柚（金柚）幼苗用营养液培养18周，培养液有无铝和1.2mMAlCl3溶液还有500uMSNP，SNP是一氧化氮的供体。

除了增加1.2mMAlCl3和10uMSNP以外，在有无铝的SNP情况下，叶的苹果酸含量没有明显变化，但是柠檬酸的含量随着SNP的供应增加而减少。

除了在铝存在加入500mMSNP情况下，根的苹果酸含量保持不变，而SNP处理的根有一个更高更相似的柠檬酸含量。

铝的下降可能没有影响根和叶的苹果酸含量和根的柠檬酸含量，但是增加了叶的柠檬酸的含量。

经过铝处理的根和叶显示出酸代谢酶的降低或者代谢活动相似，除了它们含有较高的NADP-MEandPK和相似的代谢活动和铝处理的叶子含有较高的PEPP和相似的代谢活动，这些酶包括PEPC（磷酸羧化酶）、NAD-MDH（NAD-苹果酸脱氢酶）、NADP-ME（NADP-苹果酸酶）、CS（柠檬酸合酶）、ACO（乌头酸酶）、NADPIDH（NADP-异柠檬酸脱氢酶）、PEPP（磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶）、PK（丙酮酸激酶）。

总之，柚叶和根中的OA新陈代谢与一氧化氮和铝相互作用的影响是不同的。

关键词：

柠檬酸金柚苹果酸一氧化氮有机酸代谢SNP和NO的相互作用

1前言

酸性土壤中包括世界上50％的潜在耕地土地。

在许多热带和亚热带地区的酸性土壤中，铝毒是限制作物产量的主要因素（Jiang,etal.2009）。

大量数据表明，铝诱导跟分泌有机酸阴离子是植物耐铝主要的机制。

在黑麦和柑橘处理中，铝诱导根柠檬酸分泌时伴随柠檬酸合酶和柠檬酸含量的增加。

耐铝的大豆经过铝处理后，根尖柠檬酸分泌不受铝的影响，然而柠檬酸合酶的活动增加（Gratão,etal.2005）。

番茄（荞麦）的根在铝处理下，NAD-苹果酸脱氢酶蛋白受到强烈的抑制，从中观察到在500uM磷处理的柚根中的磷酸羧化酶、柠檬酸合酶、乌头酸酶、NADP-异柠檬酸脱氢酶代谢活动降低，但是根苹果酸和柠檬酸的含量不受影响。

相反地，在50uM磷处理的柚根中的磷酸羧化酶、柠檬酸合酶、乌头酸酶、NADP-异柠檬酸脱氢酶代谢活动不受影响，但是根苹果酸和柠檬酸的含量下降了。

最近，我们对于C柚和脐橙的研究表明：

在有铝诱导分泌苹果酸和柠檬酸的含量比无铝诱导要更高，但是铝预培养没有增加跟的苹果酸和柠檬酸的含量。

C柚和冬虫夏草根部的酶酸代谢也受到铝的影响。

铝处理的一些植物物种的叶子改变了OA的代谢，野牡丹的叶对铝的反应是柠檬酸、草酸和苹果酸的含量提高，虽然铝没有影响荞麦的细胞液中的草酸浓度表明了草酸浓度不同于荞麦叶细胞液的铝浓度有高低在同一位点（Tian,etal.2007）。

当草酸与铝的比低于3.0时，柠檬酸的浓度随着铝的浓度的增加而增加。

最近我们对于C柚的研究表明，铝处理的叶子苹果酸和柠檬酸的含量随着磷供应的增加而降低，但是没有铝处理的叶子随着磷的供应没有显著的改变。

铝处理的叶子表明除了低于50uM磷处理的的PEPC和低于50-100uM磷处理的，其他低于或者相似的PEPC、CS、NADP-IDH、NAD-MDH、NADP-ME、磷酸磷酸酶和丙酮酸激酶，铝处理的比没有铝处理的高。

有证据表明，一氧化氮（NO）是一种植物体内各种生理功能的重要信号（WagatsumaandEzoe1985），能够缓解一些植物的铝毒害性，包括水稻、决明子、芙蓉、小麦、花生、黑麦、和豆类。

最近，chen等人观察到C柚根和叶中的OA代谢随着磷与铝的相互作用而有不同的变化进而引起根和叶的铝含量变化（WangandYang2005）。

之前的工作表明SNP（NO的供体）对决明子、水稻、黑麦、小麦的根系铝处理的有抑制作用，并使根顶点和根细胞壁的铝的含量积累减少。

从我们实验室的初步研究表明，SNP增加了C柚根部铝的含量，但是减少了叶中铝的含量。

因此，NO可能参与了铝对根和叶的OA代谢引起的变化。

柑橘属于常绿的叶热带果树，耕种于世界主要酸性土壤的湿润半湿润的热带、亚热带和温带地区。

低pH和高浓度的铝是不好的柑橘生长和树木寿命缩短的因素。

以往的研究表明，SNP增强了橙子耐高氯化钠和过氧化氢的能力，NO的互作存在于柑橘类植物的网络信号。

据我们所知，已知的SNP对柑橘类植物的铝毒害有缓解作用。

在这项研究中，我们研究的SNP和Al相互作用影响C柚根和叶中的铝、苹果酸和柠檬酸的含量以及活动酸代谢酶。

这项研究的目的是了解NO和Al相互作用影响根和叶的OA代谢，探讨一下柚叶和根中的有机酸代谢与一氧化氮和铝相互作用的影响是不同的。

2材料与方法

2.1研究方法与处理

酸蜜柚的种子再用填充沙子的塑料托盘培养，五周后发芽，然后将幼苗分别移植到6L的沙盆中培养。

在中国的福州福建农林大学的温室中自然光照下培养幼苗，每个盆中放两株幼苗。

每两天给每盆提供500毫升的营养液，营养也含有下列大量元素营养（毫升）：

KNO3,1；Ca（NO3）2,1；KH2PO4,0.1；MgSO4,0.5；微量元素营养（微毫升）：

H3BO3,10；MnCl2,2；ZnSO4,2；CuSO4,0.5；（NH4）6Mo7O24,0.065；；Fe-EDTA,20。

移栽后的六个星期，处理开始于并且应用于18周。

包括六种处理：

-Al、+Al（1.2mMAlCl3·6H2O）、-Al+SNP（10uM）、+Al（1.2mMAlCl3·6H2O）+SNP（10uM）、-Al+SNP（5000uM）、+Al（1.2mMAlCl3·6H2O）+SNP（500uM）。

为了了解SNP的作用，将500或者490uMSNP类似物添加到含有0或者10uMSNP处理当中。

用盐酸或者氢氧化钠调节营养液的pH值调整到4.1-4.2.在实验结束后，对不同处理的叶进行全面的测量。

中午叶片（0.608平方厘米）吸收充足的阳光后立即在液氮中冷冻。

对不同处理的幼苗根切除大约5毫米长的根尖和叶并立即放入液氮中冷冻。

叶和根样本放在-80◦C存储直到提取。

2.2测植株的干重（DW）

在实验中，从实验不同处理中的植物抽取10-11%进行采样。

将样品放在80◦C处理48小时，并在DW测量。

2.3叶片和根系中铝含量的测定

叶片和根系硝酸的混合物消化：

高氯酸（5:

1V/V）。

在铝试剂处理的溶液当中测量铝的含量。

2.4叶片和根系的苹果酸和柠檬酸的测定

苹果酸和柠檬酸的提取可以根据杨等人的研究论文。

简单地说，大约冻结的100毫克的根尖和三片叶片（总共1.824平方厘米）分别用研钵和液氮，并加入1.6毫升冰冷的4%（V/V）高氯酸轻轻嚼碎。

混合物要在冰上慢慢解冻。

不断产生悬浮冰30分钟，然后再2000转4◦C的离心机上离心10分钟，在4◦C提取1.2毫升的上清液再加入5MK2CO3（大约80毫升）和由此产生的KClO3混合后放在2000转4◦C的离心机上离心10分钟。

12毫克的碳添加到上清液中十分钟后2000转4◦C的离心机上离心10分钟。

取其上清液用于测量苹果酸和柠檬酸。

苹果酸测定按照陈等人的研究论文并加以修改。

1毫升反应混合物中包括50mM3-氨基-1-丙醇-盐酸（pH10）、30mM谷氨酸-钠-氢氧化钠（pH10）、2.7mMNAD、1个单位谷氨酸草酰乙酸转氨酶、10单位的NAD-MDH、2mMEDTA和50ul上清液。

柠檬酸是根据陈等人的研究论文并加以修改。

1毫升的反应混合物包括：

100mM的Tris-HCl（pH7.6）、0.2mMNADH、7单位的乳酸脱氢酶、14单位的NAD-MDH、0.5单位的柠檬酸裂解酶、2mMEDTA和200ul的上清液。

2.5叶片和根系酸代谢酶活力的测量

PEPC（磷酸羧化酶）、NAD-MDH（NAD-苹果酸脱氢酶）、NADP-ME（NADP-苹果酸酶）、CS（柠檬酸合酶）、ACO（乌头酸酶）、NADPIDH（NADP-异柠檬酸脱氢酶）、PEPP（磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶）、PK（丙酮酸激酶）的提取根据陈等人的研究论文并加以修改。

简单来说，三四片冷冻的叶片或者80-160mg冷冻的根尖用含有50毫升Hepes-KOH（pH7.5）、2mMEDTA、10mMDTT、1%（w/v）TritonX-100、30%（w/v）甘油、1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）、5%（w/v）PVPP和1毫升苯甲基磺酰氟（PMSF）。

提取物放在13000转4◦C的离心机上离心10分钟，取其上清液用于活动检测叶片和根尖的柠檬酸合酶，其活动被检测的酶除外脱盐后的上清液通过经SephadexG-25（PD-10，Pharmacia公司）与10mMHEPES-KOH（PH7.5）平衡。

根据陈等所有酶测定研究论文。

检测ACO的1毫升反应混合物中含有85mMHEPES-KOH（PH7.5）、10mMMgSO4,5mMMnCl2,1mMDTT,0.5mMNADP,1单元的NADP-IDHand160uL酶提取液。

反应开始加入10mM顺乌头酸盐。

PEPC的检测1毫升反应混合物中含有50mMTris-HCl（pH8.0）、5mMMnCl2、2mMDTT、10mMNaHCO3、0.2mMNADH、5单位的NAD-MDH和160uL酶提取液。

反应最初是通过增加2.5mMPEP。

NAD-MDH检测的1毫升反应混合物中含有50mMTris-HCl（pH8.1）、5mMMgSO4、1mMDTT、1mMEDTA、0.2mMNADH和5uL酶提取液。

反应开始加入1毫升的草酰乙酸。

NADP-ME检测的1毫升反应混合物中含有50mMTris–HCl（pH7.8）、5mMMgSO4、5mMMnCl2、0.5mMNADP和200uL酶提取液。

反应开始加入5mM苹果酸。

NADP-IDH检测的1毫升反应混合物中含有100mMHepes–KOH（pH7.5）、5mMMgSO4、5mMKCl、0.5mMNADP和160uL酶提取液。

反应开始加入5mM异柠檬酸。

PK检测的1毫升反应混合物中含有100mMimidazole–HClpH7.0、50mMKCl、10mMMgCl2、0.05%（w/v）BSA、2mMDTT、150uMNADH、1单位的LDH、2mMADP和100uL酶提取液。

反应开始加入2mMPEP。

在缺少ADP的情况下PEPP结果低于相同条件下的，PK的活性纠正了PEPP的活性。

CS检测的1毫升反应混合物中含有50mMTris–Cl（pH8.1）、0.1mM5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzicacid）、0.2mM乙酰辅酶A、1mM草酰乙酸和160uL酶提取液。

反应开始加入1mM草酰乙酸，并对A412增加进行检测。

2.6实验设计和统计分析

每次处理共有20盆（共40株幼苗）是完全随机设计的。

每次处理5-11重复（不同重复不同盆），结果代表平均值±SE。

数据进行统计分析通过方差分析测试，通过相隔最少的显著差异（LSD）检测，显著水平P<0.05。

3结论

3.1生长的幼苗叶片和根系铝的含量

在没有铝处理的植物中，植株干重0uMSNP处理的重于10uMSNP处理的，然而在有铝处理的植物中，植株干重10uMSNP处理的重于0uM或者500uMSNP处理的。

铝抑制幼苗的生长（如图1A）。

铝处理增加叶片和根系中铝的含量。

在有铝处理的叶片当中，叶片中铝的含量0uMSNP处理的多于10uM或者500uMSNP处理的，而根系中铝的含量随着SNP的供体增加而增加。

在没有铝处理的叶片和根系在有SNP供体存在的情况下没有显著的改变（如图1B和C）。

图1.SNP和Al对幼苗生长和幼叶

和根铝含量相互作