第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选.docx
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第4章GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选
第4章GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选
用B-Domain蛋白作为亲和材料纯化抗体时，由于其与IgG结合能力较强，在用于抗体纯化的洗脱过程中，洗脱条件苛刻，需要pH2.4的洗脱缓冲液，这种极端条件会很大程度地破坏抗体的活性，从而影响所纯化抗体的使用价值。
而B-Domain用于抗体的定向固定时，则是其抗体结合力越强，越有利于定抗体的定向固定。
噬菌体展示技术作为一种分子体外进化技术，经常应用于蛋白质或多肽的改造。
鉴于此，本文构建了GB2的随机突变文库，首先是采用易错PCR将GB2进行随机突变，将突变PCR产物克隆至噬菌粒pHENI中，然后用电转化的方式，将连接产物转化至E.coliTG1中，构建了mtGB2的随机突变文库，用M13K07辅助噬菌体感染TG1文库，得到mtGB2的噬菌体展示文库。
以IgG为淘选靶分子，对文库进行两个方向的淘选，一个是淘选在pH4.0的洗脱缓冲液中能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体纯化领域；一个是在pH2.4仍不能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体的定向固定。
图4-2亲和力减弱文库A淘选过程示意图
Fig.4-2SchematicofthepanningoflibraryA
图4-3亲和力增强文库B淘选过程示意图
Fig.4-3SchematicofthepanningoflibraryB
4.1材料、仪器与试剂
4.1.1材料
E.coliTG1购自Invitorgen、噬菌粒pHENI、HelpphageM13K07由英国剑桥医学研究委员会（MRC）分子生物学实验室GregWinter博士惠赠；小鼠腹水由本实验室制备。
4.1.2主要仪器
—BIO-RAD凝胶成像系统BIO-RAD公司
—低温离心机（2K-15）Sigma公司
—PCR扩增仪（GeneAmpPCRsystem2400型）PE公司
—型稳压电泳仪（DYY-IⅢ）北京六一仪器厂
—超低温冰箱（CD-196/HC）Thermo公司
—电转仪Bio-Rad公司
—电击杯Bio-Rad公司
—超纯水制备仪（67120）美国Millipore公司
—恒温摇床上海智诚
—96孔酶标板美国Costar公司
—37℃恒温孵育箱日本SANYO
—型全自动灭菌锅（MLS-3750）日本SANYO公司
—酶联免疫检测仪（MK2）Labsystems公司
4.1.3试剂
TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、限制性内切酶（XhoⅠ、NcoⅠ、SalⅠ）、DL2000DNAmarker、λ-HindⅢDNAmarker，DNA片段纯化试剂盒、AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0、质粒提取试剂盒均购买与TaKaRa公司；T4DNAligase购自NEB公司；Goldview核酸染料购自博大泰克生物基因技术有限责任公司；Yeastextract、Tryptone购自Oxoid公司；其他普通化学药品与试剂都是国产分析纯。
4.1.4溶液与培养基
1）LB：
在900mL蒸馏水中加10gTryton，5gYeastExtract，10gNaCl，溶解后加水至一升，用NaOH调节pH至7.4；
2）SOB培养基：
20g/LTrypone，5g/LYeastExtract，0.5g/LNaCl，高压冷却至
55℃后加入1mol/L的无菌MgCl210mL，250mmol/LKCl10mL；
3）SOC培养基：
除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同；
4）SOB平板：
4g胰蛋白胨，1g酵母膏，0.1gNaCl，0.188gKCl，2.03g
MgCl2，0.986gMgSO4，3.6g琼脂粉，加ddH2O至200mL，高压灭菌，冷却后加入200µL100mg/mL氨苄青霉素，混匀后立即铺平皿，4℃保存备用。
5）2×YT：
在900mLddH2O中加16g胰蛋白胨，10g酵母膏，5gNaCl，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，高压灭菌备用。
6）2×YT-G：
2×YT培养基中加入2%的葡萄糖；
7）2×YT-AG：
2×Y-GT培养基中加入100µg/mL的氨苄青霉素；
8）2×YT-AK：
2×YT培养基中加入100µg/mL的氨苄青霉素和50µg/mL的卡那霉素；
9）上层琼脂：
每升10g胰蛋白胨，5g酵母膏，5gNaCl，1gMgCl2.6H2O，7g琼脂粉，融化后分装试管3mL/管，高压灭菌，用时用微波炉融化，每加入10µL2M的MgCl2。
10）PEG-NaCl：
20％（w/v）PEG8000，称量200gPEG8000，146.1gNaCl，溶解于800mL去离子水中，定容至1L，高压灭菌，室温储存。
11）PBS：
称取NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g，加蒸馏水定容至1000mL。
12）洗涤缓冲液PBST：
称取NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g，加蒸馏水定容至1000mL，再加入Tween-200.5mL。
13）0.1MGly-HCl（pH2.4、4.0、6.0）：
称取0.75gGly，溶解于与100mL去离子水中，用HCl溶液分别将pH调节至pH2.4、4.0、6.0。
14）1MTris-HCl（pH9.0）称取12.1gTris，溶解于去离子水中，定容至100mL，调节pH至9.0。
4.2实验方法与步骤
4.2.1野生型pHENI-wtGB2质粒的构建
1）合成引物
pHEN-GB2-NcoI：
GCACCATGGcaACTTACAAATTAATCCTTAATGG（NcoI）
pHEN-GB2-XhoI：
GACCTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC（XhoI）
pHEN-F：
CAGGAAACAGCTATGACC
pHEN-R：
GCCCCATTCAGATCCTCTTC
2）以pGEX-GB2为模板，pHEN-GB2-NcoI、pHEN-GB2-XhoI为引物进行PCR，扩增GB2片段。
3）分别NcoI/XhoI双酶切pHENI噬菌粒与PCR产物，分别割胶回收纯化。
4）用T4连接酶将GB2克隆至pHENI噬菌粒中，转化E.coliDH5a细胞。
5）菌落PCR、NcoI/XhoI双酶切验证所得克隆子，选取阳性克隆子送测序。
4.2.2GB2的随机突变
1）易错PCR对mtGB2进行随机突变，进行4组,每组的体系不同，分别降低一种dXTP的浓度至10%，引物为pHEN-F、pHEN-R，每管100μL体系，如下表：
表4-1易错PCR体系
Table4-1ThereactionsystemoferrorPCR
1
2
3
4
其他条件
﹡
﹡
﹡
﹡
dATP
0.02mmol/L
0.2mmol/L
0.2mmol/L
0.2mmol/L
dTTP
0.2mmol/L
0.02mmol/L
0.2mmol/L
0.2mmol/L
dCTP
0.2mmol/L
0.2mmol/L
0.02mmol/L
0.2mmol/L
dGTP
0.2mmol/L
0.2mmol/L
0.2mmol/L
0.02mmol/L
﹡pHENI-wtGB2：
0.2ng；MnCl2：
0.5mmol/L；MgCl2：
5mmol/L；Taq:
5U；上、下引物各20pmol。
反应条件：
94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。
2）将4组易错PCR产物合并，用DNA片段回收试剂盒回收。
3）取部分回收产物进行TA克隆，挑取阳性克隆子送测序，分析随机突变效果。
4.2.3mtGB2与pHENI连接
1）用XhoI和NcoI两种限制性内切酶对mtGB2片段和pHENI噬菌粒进行双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用割胶试剂盒分别回收纯化，分别定量。
2）连接体系为50µL，按摩尔比5:
1投入GB2与pHENI，2.5µLT4连接Buffer，T4连接酶为0.5µL（350U），16℃反应过夜，共进行4管。
3）向连接产物中加入无水乙醇至终浓度为70%，-20℃沉淀过夜，4℃，10000rpm离心20min，去上清，用70%乙醇洗涤沉淀两次，待乙醇除干净后将沉淀溶解于20µL的无菌水中。
4.2.4电转感受态细胞的制备
1）从LB平板上挑取一个单菌落，接种于5mL的SOB培养基中，37℃振荡培养过夜；
2）按1:
100的比例将TG1过夜培养物接种到500mLSOB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4；
3）将培养物冰浴30min，4℃，550g离心10min，沉淀细胞；
4）弃上清，用500mL预冷的无菌水水，4℃，550g离心10min，沉淀细胞；
5）弃上清用250mL预冷的无菌10%甘油溶液重悬细胞，4℃，600g离心10min，沉淀细胞；
6）用15mL预冷的无菌10%甘油溶液重悬细胞，4℃、600g离心10min，沉淀细胞；
7）将细胞悬浮在1mL预冷的CYT溶液中，将菌液按50µL/管分装在预冷的0.5mL离心管中，封紧管口，迅速没入液氮中冻存，保存于-70℃。
4.2.5电转化
1）将50µL感受态细胞从冰箱取出，冰上融化，加入2µL连接产物，混匀，冰上放置1min；（将所有的连接产物分多次进行电转）；
2）将上述混合液转入0.2cm的电击杯中，调节电击参数：
电压为2.5kv，电场强度：
12.5kv/cm；
3）立即在电击杯中加入1mLSOC培养基，悬浮细胞，37℃培养1h；
4）取5µL适当梯度稀释，每个梯度分别取200µL涂布两块SOB-AG平板，37℃培养过夜，计算两块平板上的菌落数，用于计算库容；
库容＝菌落总数/2×稀释倍数×菌液总体积（mL）/0.2×103
5）将剩余的培养物均分涂布平板，使得每块平板上的单菌落的疏密程度合适（不重合，但又不至于太稀），37℃培养过夜；
6）从平板上挑取一些转化子，进行PCR验证，分析插入率。
目的基因插入率＝插入GB2的阳性克隆数/挑取的转化子总数×100%
实际库容＝库容×目的基因插入率
7）每块平板上加入1mL2×YT培养基，用灭菌的药匙将细菌洗脱，将所有平板的细菌悬液合并，混匀。
取5mL细菌悬液用于噬菌体挽救，剩余的菌液则制备成20%的甘油保存液，–70℃冻存，此即为GB2随机突变大肠杆菌文库。
4.2.6辅助噬菌体滴度的测定
1）接种TG1于5mL2×YT培养基中，摇床培养至对数期后置于4℃预冷。
（可保存一周）
2）将试管中的3mL上层琼脂融化，将其温度平衡至48℃，每测一个滴度准备一管。
3）用2×YT培养基对待测辅助噬菌体噬菌体进行10倍梯度稀释。
4）将预冷的TG1培养物分装于1.5mL离心管中，每管100µL，每个稀释梯度一管。
5）将100µL不同稀释度的噬菌体分别加入到TG1培养物中，快速振荡混匀，37℃温育5min。
6）将温育后的混合物加入至上层琼脂中，迅速混匀后倾倒在2×YT平板上，待培养基凝结后倒置平板，37℃培养过夜，计算平板上的噬菌斑数量，以噬菌斑为30-300个左右的平板计数为准，计算噬菌体溶液的滴度。
4.2.7M13K07辅助噬菌体的扩增
1）从噬菌体滴度测定平板上，用牙签挑取一个独立的、噬菌斑较大的噬菌斑接种到5mL2×YT-K试管中，37℃、250rpm培养12h。
2）取500µL培养物接种到装有50mL2×YT-K培养基的三角瓶中，30℃、250rpm培养过夜。
3）收集过夜培养物，10000rpm离心20min，收集上清，含有噬菌体。
4）加入1/5体积的PEG/NaCl，充分混匀，让噬菌体4℃沉淀至少60min，最好过夜；
5）10000rpm离心20min，去上清，收集沉淀，溶解于8mL无菌PBS中。
6）测定M13K07溶液的滴度。
4.2.8GB2随机突变噬菌体文库的构建
1）将5mL细菌悬液转移至一50mL的离心管中，用2×YT培养基调整OD600至0.3，记录最终体积。
加入Amp使其终浓度为100µg/mL，加入无菌葡萄糖使其终浓度为2％，37℃振荡培养1h；
2）按phage：
cell=20：
1加入辅助噬菌体，37℃振荡培养2h；
3）1000g离心10min，弃上清，用50mL2×YT-AK培养基轻轻悬浮细胞，30℃振荡培养过夜；
4）收集培养物，10000g离心20min，将上清转移至10mL离心管中，上清中含有重组噬菌体；
5）加入1/5体积的PEG/NaCl，充分混匀，让噬菌体4℃沉淀至少60min，最好过夜；
6）4℃、1000g离心20min，倒掉上清，再次短暂离心，吸去残留的上清；
7）加入2mLPBS-1%BSA溶液重悬细胞，悬液转入10mL离心管中，4℃离心5min，沉淀残余的细胞；吸取上清，为并分装于1.5mL离心管中，加入50%甘油，-70℃保存备用。
此即为原始的GB2随机突变噬菌体文库；
8）测定文库滴度。
4.2.9噬菌体展示文库滴度的测定及无菌实验
1）接种TG1于5mL2×YT培养基中，摇床培养至对数期；
2）用SOB培养基10倍梯度稀释待测噬菌体文库；
3）待TG1培养物达到对数中期时，将其200µL等分于1.5mL离心管中，每个稀释梯度一管；
4）每管加入10µL的不同稀释度的噬菌体，快速振荡混匀，37℃温育10min，
5）将孵育后产物涂布于SOB-AG平板上，37℃倒置培养过夜。
6）计算平板上的单菌落数，计算噬菌体文库的滴度；
7）取10µL噬菌体涂布平板，37℃培养过夜，看是否有菌落生长。
4.2.10筛选靶分子鼠IgG的纯化
1）收集1mL小鼠腹水，4℃10000rpm离心10min，除去沉淀，将上清用0.45µm滤膜过滤，除去不溶性的小颗粒。
2）取1.5mLProteinGSepharose加入到层析柱中，用10倍体积的PBS进行过柱洗涤，注意液面，加上塞子，防止树脂暴露于空气中干燥。
3）加入0.5mL过滤后的小鼠腹水与0.5mLPBS混匀，盖上盖、塞后室温轻轻混匀15min，然后除去盖、塞，让液体流出。
4）加入10倍体积的PBS洗涤层析柱中树脂。
5）加入1mL0.1MGly-HCl（pH2.5）洗脱缓冲液，过柱洗脱，收集洗脱液，迅速加入适量的1MTris-HCl（pH9.0）中和缓冲液进行中和。
6）将获得的IgG洗脱液进行SDS-PAGE分析其纯度和浓度。
4.2.11IgG结合力减弱文库A的淘选
1）用PBS稀释IgG至终浓度为5μg/mL，按100µL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜。
2）PBST洗涤3次，加入2%BSA37℃封闭2h。
3）PBST洗涤3次，加入100µLPHEN-mtGB2噬菌体展示文库，噬菌体数量为1011cfu，37℃孵育1.5h。
4）用pH6.0的PBS洗涤缓冲液洗涤3次，然后加入300µL该缓冲液，37℃12min。
5）用pH6.0的PBS洗涤缓冲液洗涤10次，加入200µLpH4.0的Gly-HCl洗脱缓冲液，37℃孵育25min，将该洗脱缓冲液转移至一无菌离心管中，用中和缓冲液中和。
6）取10µL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余则加入至1mLTG1对数期培养物进行感染，37℃孵育1h，保存备用进行文库的扩增。
7）将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表4-2。
表4-2亲和力减弱文库A（pH4.0-6.0）各轮的淘选条件
Tab.4-2ThepanningconditionofeachroundsofthelibraryA（pH4.0-6.0）
轮次
IgG包被量（µg）
文库投入量（cfu）
洗涤时间（min）
洗脱时间（min）
1
0.5
1.0×1011
12
25
2
0.25
1.0×1011
15
25
3
0.1
2.0×1010
20
20
4
0.1
1.0×1010
20
15
4.2.12IgG结合增强文库B的淘选
1）用PBS稀释IgG至终浓度为5µg/mL，按100µL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜。
2）PBST洗涤3次，加入2%BSA37℃封闭2h。
3）PBST洗涤3次，加入100µLpHEN-mtGB2噬菌体展示文库，噬菌体数量为1011cfu，37℃孵育1.5h。
4）用pH7.0的PBST洗涤缓冲液洗涤10次。
5）用0.1MGly-HCl（pH2.4）洗涤缓冲液洗涤3次，加入300µL该缓冲液，37℃孵育12min，再用0.1MGly-HCl（pH2.4）洗涤缓冲液洗涤3次，然后用pH7.0的PBST洗涤缓冲液洗涤3次。
6）加入200µLTG1对数期培养物，37℃感染1h。
7）取出感染后TG1培养物，取10µL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余则进行文库的扩增。
8）将扩增后文库进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表4-3。
表4-3亲和力减弱文库B（pH＜pH2.4）各轮的淘选条件
Tab.4-3ThepanningconditionofeachroundsofthelibraryB（pH＜pH2.4）
轮次
IgG包被量（µg）
文库投入量（cfu）
洗涤时间（min）
1
0.5
1.0×1011
12
2
0.25
2.0×1010
15
3
0.1
5.0×109
20
4
0.1
5.0×109
25
4.2.13淘选后文库的扩增
1）将文库感染物产物加入至3mL2×YT-G培养基中，37℃、225rpm振荡培养1h，加入Amp至终浓度为100ng/mL，同时按cell：
phage=1：
20的比例加入M13K07噬菌体，37℃、225rpm振荡培养2h。
2）将培养物分装于离心管中，1000rpm，5min，收集菌体，加入至20mL2×YT-AK培养液中，30℃，250rpm振荡培养过夜。
3）将过夜培养物10000rpm离心20min，收集上清，每5mL上清中加入1mLPEG/NaCl，混匀后置于4℃1h以上，最好是过夜。
4）10000rpm，20min，去除上清，将沉淀重悬于2mLTBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃1h以上。
5）10000rpm，20min，去除上清，将沉淀悬浮于400µLTBS-1%BSA中，即为该轮淘选后文库，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。
4.3实验结果
4.3.1野生型pHENI-GB2质粒的构建
通过NcoI和XhoI将野生型wtGB2克隆至pHENI中，菌落PCR验证后提取阳性克隆子的质粒，用NcoI和XhoI进行双酶切验证，结果获得两条带，分别与空载体和外源片段大小一致，说明载体构建成功（图4-4）。
进一步经测序确正，未发现突变。
图4-4pHENI-wtGB2重组质粒的NcoI和XhoI双酶切验证图
Fig.4-4IdentificationofthepHENI-wtGB2byrestrictionenzymeofNcoIandXhoI
M1:
λ-HindⅢdigestDNAmarker；M2:
DL2000marker；
1:
pHENI噬菌粒双酶切样品；2:
pHENI-wtGB2重组噬菌粒双酶切样品；
3:
mtGB2DNA片段双酶切样品
4.3.2GB2的随机突变
以pHENI-wtGB2重组噬菌粒为模板，pHEN-F和pHEN-R为引物，采用易错PCR方法对GB2进行随机突变，分四管进行，四管分别将一种脱氧核苷酸的浓度降低90%，每个反应都进行35个循环。
1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，四个反应均成功进行，产物浓度、大小也一致（见图4-5）。
图4-5易错PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.4-5Analysisoftheerror-PCRproducts
M：
DL2000Marker；1、2、3、4：
分别为减少90%的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的易错PCR扩增产物；
将4管易错PCR产物混合，经乙醇沉淀浓缩纯化，取部分进行TA克隆，经菌落PCR验证后，挑取4个克隆子送测序，用DNASTAR软件将其与野生型GB2片段进行比较，分析随机突变情况。
由图4-6可以看出共发生了29处点突变，突变率约为1.93%。
随机突变位点的分布位置是随机的，没有出现突变热点。
就突变碱基而言，主要是A、T发生突变，占了约82%，突变结果表现出了一定的偏向性。
图4-6随机突变产物的氨基酸突变结果分析图
Fig.4-6ComparisonoftheaminoacidsequencesbetweenwtGB2andfourmtGB2clonesfromerror-PCR
黄色：
发生点突变；红色：
未发生点突变
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