第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选.docx

1、第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选第 4 章 GB2随机突变噬菌体文库的构建及淘选 用 B-Domain 蛋白作为亲和材料纯化抗体时，由于其与 IgG 结合能力较强，在用于抗体纯化的洗脱过程中，洗脱条件苛刻，需要 pH2.4 的洗脱缓冲液，这种极端条件会很大程度地破坏抗体的活性，从而影响所纯化抗体的使用价值。而 B-Domain 用于抗体的定向固定时，则是其抗体结合力越强，越有利于定抗体的定向固定。噬菌体展示技术作为一种分子体外进化技术，经常应用于蛋白质或多肽的改造。鉴于此，本文构建了 GB2 的随机突变文库，首先是采用易错 PCR 将 GB2 进行随机突变，将突变 PCR 产物

2、克隆至噬菌粒 pHEN I 中，然后用电转化的方式，将连接产物转化至 E.coli TG1 中，构建了 mtGB2 的随机突变文库，用 M13K07 辅助噬菌体感染 TG1 文库，得到 mtGB2 的噬菌体展示文库。以 IgG 为淘选靶分子，对文库进行两个方向的淘选，一个是淘选在 pH4.0 的洗脱缓冲液中能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体纯化领域；一个是在 pH2.4 仍不能被洗脱的突变型，能更好地应用于抗体的定向固定。图4-2亲和力减弱文库 A 淘选过程示意图Fig. 4-2 Schematic of the panning of library A图4-3 亲和力增强文库 B 淘选过程

3、示意图Fig. 4-3 Schematic of the panning of library B4.1 材料、仪器与试剂4.1.1材料E.coli TG1 购自Invitorgen、噬菌粒 pHEN I、Help phage M13K07 由英国剑桥医学研究委员会 (MRC) 分子生物学实验室 Greg Winter 博士惠赠；小鼠腹水由本实验室制备。4.1.2主要仪器BIO-RAD 凝胶成像系统 BIO-RAD 公司低温离心机（2K-15） Sigma 公司PCR 扩增仪（Gene Amp PCR system 2400型） PE 公司型稳压电泳仪（DYY-I ） 北京六一仪器厂超低温冰箱

4、（CD-196/HC） Thermo 公司电转仪 Bio-Rad 公司电击杯 Bio-Rad 公司超纯水制备仪（67120） 美国 Millipore公司恒温摇床 上海智诚96 孔酶标板 美国 Costar 公司37 恒温孵育箱 日本SANYO型全自动灭菌锅（MLS-3750） 日本 SANYO 公司酶联免疫检测仪（MK2） Labsystems 公司4.1.3试剂 Taq DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、限制性内切酶（Xho、Nco、Sal）、DL2000 DNA marker、-Hind DNA marker，DNA 片段纯化试剂盒、Agarose Gel DNA Purif

5、ication Kit Ver.2.0、质粒提取试剂盒均购买与TaKaRa 公司；T4 DNA ligase 购自NEB公司；Goldview 核酸染料购自博大泰克生物基因技术有限责任公司；Yeast extract、Tryptone 购自 Oxoid 公司；其他普通化学药品与试剂都是国产分析纯。4.1.4 溶液与培养基 1） LB：在900 mL 蒸馏水中加 10 g Tryton，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，溶解后加水至一升，用 NaOH 调节 pH 至 7.4；2）SOB 培养基：20 g/L Trypone，5 g/L Yeast Extract，0.5 g

6、/L NaCl，高压冷却至55 后加入 1 mol/L 的无菌 MgCl2 10 mL，250 mmol/L KCl 10 mL；3）SOC 培养基：除含有 20 mmol/L 葡萄糖外，其他成分与 SOB 培养基相同；4）SOB 平板：4 g 胰蛋白胨，1 g 酵母膏，0.1 g NaCl，0.188 g KCl，2.03 gMgCl2，0.986 g MgSO4，3.6 g 琼脂粉，加 ddH2O 至 200 mL，高压灭菌，冷却后加入 200 L 100 mg/mL 氨苄青霉素，混匀后立即铺平皿，4 保存备用。5）2YT：在 900 mL ddH2O 中加 16 g 胰蛋白胨，10 g

7、酵母膏，5 g NaCl，加 ddH2O 至 1 L，调节 pH 至 7.0，高压灭菌备用。6）2YT-G：2YT 培养基中加入 2% 的葡萄糖；7）2YT-AG：2Y-GT 培养基中加入 100 g/mL 的氨苄青霉素；8）2YT-AK：2YT 培养基中加入 100 g/mL 的氨苄青霉素和 50 g/mL 的卡那霉素；9）上层琼脂：每升 10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母膏，5 g NaCl，1gMgCl2.6H2O，7 g琼脂粉，融化后分装试管 3 mL/管，高压灭菌，用时用微波炉融化，每加入10L 2M的MgCl2。10）PEG-NaCl：20（w/v）PEG 8000，称量 200 g

8、 PEG 8000，146.1 g NaCl，溶解于 800 mL 去离子水中，定容至 1 L，高压灭菌，室温储存。11）PBS：称取 NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO412H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水定容至 1000 mL。12）洗涤缓冲液 PBST：称取 NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO412H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，再加入 Tween-20 0.5 mL。13）0.1 M Gly-HCl（pH2.4、4.0、6.0）：称取 0.75 g Gly，溶解于与 100 mL

9、 去离子水中，用 HCl 溶液分别将 pH 调节至 pH2.4、4.0、6.0。14）1 M Tris-HCl(pH9.0)称取 12.1 g Tris，溶解于去离子水中，定容至 100 mL，调节pH至9.0。4.2 实验方法与步骤4.2.1 野生型 pHEN I-wtGB2 质粒的构建1）合成引物pHEN-GB2-Nco I：GCACCATGG ca ACTTACAAATTAATCCTTAATGG (Nco I)pHEN-GB2-Xho I：GACCTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGTC(Xho I)pHEN-F：CAGGAAACAGCTATGACC pHEN-R：G

10、CCCCATTCAGATCCTCTTC2） 以 pGEX-GB2 为模板，pHEN-GB2-Nco I、pHEN-GB2-Xho I为引物进行PCR，扩增 GB2 片段。3）分别 NcoI/XhoI 双酶切 pHEN I 噬菌粒与 PCR 产物，分别割胶回收纯化。4）用 T4 连接酶将 GB2 克隆至 pHEN I 噬菌粒中，转化 E.coli DH5a 细胞。5）菌落 PCR、NcoI/XhoI 双酶切验证所得克隆子，选取阳性克隆子送测序。4.2.2 GB2 的随机突变1）易错 PCR 对 mtGB2 进行随机突变，进行 4 组, 每组的体系不同，分别降低一种 dXTP 的浓度至 10%，引

11、物为 pHEN-F、pHEN-R，每管 100 L体系，如下表：表4-1 易错 PCR 体系Table 4-1 The reaction system of error PCR1234其他条件dATP0.02mmol/L0.2mmol/L0.2mmol/L0.2mmol/LdTTP0.2mmol/L0.02mmol/L0.2mmol/L0.2mmol/LdCTP0.2mmol/L0.2mmol/L0.02mmol/L0.2mmol/LdGTP0.2mmol/L0.2mmol/L0.2mmol/L0.02mmol/LpHENI-wtGB2：0. 2 ng；MnCl2：0.5 mmol/L； Mg

12、Cl2：5 mmol/L；Taq : 5 U； 上、下引物各 20 pmol。反应条件：94 变性 30 s，62 退火 30 s，72 延伸 30 s，共 35 循环。2）将 4 组易错 PCR 产物合并，用 DNA 片段回收试剂盒回收。3）取部分回收产物进行 TA 克隆，挑取阳性克隆子送测序，分析随机突变效果。4.2.3 mtGB2与pHEN I连接1）用 Xho I 和 Nco I 两种限制性内切酶对 mtGB2 片段和 pHEN I 噬菌粒进行双酶切，1.0% 琼脂糖凝胶电泳后，用割胶试剂盒分别回收纯化，分别定量。2）连接体系为 50L，按摩尔比 5:1 投入 GB2 与 pHEN I

13、，2.5 L T4 连接Buffer，T4 连接酶为 0.5 L（350U），16 反应过夜，共进行 4 管。3） 向连接产物中加入无水乙醇至终浓度为 70%，-20 沉淀过夜，4，10000 rpm离心20 min，去上清，用 70% 乙醇洗涤沉淀两次，待乙醇除干净后将沉淀溶解于 20 L 的无菌水中。4.2.4 电转感受态细胞的制备1）从 LB 平板上挑取一个单菌落，接种于 5 mL 的 SOB 培养基中，37 振荡培养过夜；2）按 1:100 的比例将 TG1 过夜培养物接种到500 mL SOB 培养基中，37 振荡培养至 OD600 为 0.4；3）将培养物冰浴 30 min，4，5

14、50 g离心10 min，沉淀细胞；4）弃上清，用 500 mL 预冷的无菌水水，4，550 g 离心 10 min，沉淀细胞；5） 弃上清用 250 mL 预冷的无菌 10% 甘油溶液重悬细胞，4，600 g 离心10 min，沉淀细胞；6） 用 15 mL 预冷的无菌 10% 甘油溶液重悬细胞，4、600 g 离心 10 min，沉淀细胞；7） 将细胞悬浮在 1 mL 预冷的 CYT 溶液中，将菌液按 50L/管 分装在预冷的 0.5 mL 离心管中，封紧管口，迅速没入液氮中冻存，保存于 -70。4.2.5 电转化1）将 50 L 感受态细胞从冰箱取出，冰上融化，加入 2 L 连接产物，混

15、匀，冰上放置 1 min；（将所有的连接产物分多次进行电转）；2）将上述混合液转入 0.2 cm 的电击杯中，调节电击参数：电压为 2.5 kv，电场强度：12.5 kv/cm；3）立即在电击杯中加入 1 mL SOC 培养基，悬浮细胞，37 培养 1 h；4）取 5 L 适当梯度稀释，每个梯度分别取 200 L 涂布两块 SOB-AG 平板，37 培养过夜，计算两块平板上的菌落数，用于计算库容；库容 菌落总数/2 稀释倍数菌液总体积（mL）/0.2 103 5）将剩余的培养物均分涂布平板，使得每块平板上的单菌落的疏密程度合适（不重合，但又不至于太稀），37 培养过夜；6）从平板上挑取一些转化

16、子，进行 PCR 验证，分析插入率。目的基因插入率 插入 GB2 的阳性克隆数/ 挑取的转化子总数100%实际库容 库容 目的基因插入率7）每块平板上加入 1 mL 2YT 培养基，用灭菌的药匙将细菌洗脱，将所有平板的细菌悬液合并，混匀。取 5 mL 细菌悬液用于噬菌体挽救，剩余的菌液则制备成 20% 的甘油保存液，70 冻存，此即为 GB2 随机突变大肠杆菌文库。4.2.6辅助噬菌体滴度的测定1）接种 TG1 于 5 mL 2YT 培养基中，摇床培养至对数期后置于 4 预冷。（可保存一周）2）将试管中的 3 mL 上层琼脂融化，将其温度平衡至 48，每测一个滴度准备一管。3）用 2YT 培养

17、基对待测辅助噬菌体噬菌体进行 10 倍梯度稀释。4）将预冷的 TG1 培养物分装于 1.5 mL离心管中，每管 100 L，每个稀释梯度一管。5）将 100 L 不同稀释度的噬菌体分别加入到 TG1 培养物中，快速振荡混匀，37 温育 5 min。6）将温育后的混合物加入至上层琼脂中，迅速混匀后倾倒在 2YT 平板上，待培养基凝结后倒置平板，37 培养过夜，计算平板上的噬菌斑数量，以噬菌斑为 30-300 个左右的平板计数为准，计算噬菌体溶液的滴度。4.2.7 M13K07 辅助噬菌体的扩增1）从噬菌体滴度测定平板上，用牙签挑取一个独立的、噬菌斑较大的噬菌斑接种到 5 mL 2YT-K 试管中

18、，37、250 rpm 培养 12 h。2）取 500 L 培养物接种到装有 50 mL 2YT-K 培养基的三角瓶中，30、250 rpm 培养过夜。3）收集过夜培养物，10000 rpm 离心 20 min，收集上清，含有噬菌体。4）加入 1/5 体积的 PEG/NaCl，充分混匀，让噬菌体 4 沉淀至少 60 min，最好过夜；5）10000 rpm 离心 20 min，去上清，收集沉淀，溶解于 8 mL 无菌 PBS 中。6）测定 M13K07 溶液的滴度。4.2.8 GB2随机突变噬菌体文库的构建1）将 5 mL 细菌悬液转移至一 50 mL 的离心管中，用 2YT 培养基调整OD6

19、00 至 0.3，记录最终体积。加入 Amp 使其终浓度为 100 g/mL，加入无菌葡萄糖使其终浓度为 2，37 振荡培养 1 h；2）按 phage：cell=20：1加入辅助噬菌体，37 振荡培养 2 h；3）1000 g 离心 10 min，弃上清，用 50 mL 2YT-AK 培养基轻轻悬浮细胞，30 振荡培养过夜；4）收集培养物，10000 g 离心 20 min，将上清转移至 10 mL 离心管中，上清中含有重组噬菌体；5）加入 1/5 体积的 PEG/NaCl，充分混匀，让噬菌体 4 沉淀至少 60 min，最好过夜；6）4、1000 g 离心 20 min，倒掉上清，再次短暂

20、离心，吸去残留的上清；7） 加入 2 mL PBS-1%BSA 溶液重悬细胞，悬液转入 10 mL 离心管中，4 离心 5 min，沉淀残余的细胞；吸取上清，为并分装于 1.5 mL 离心管中，加入 50% 甘油，-70 保存备用。此即为原始的 GB2 随机突变噬菌体文库；8）测定文库滴度。4.2.9 噬菌体展示文库滴度的测定及无菌实验1）接种 TG1 于 5 mL 2YT 培养基中，摇床培养至对数期；2）用 SOB 培养基 10 倍梯度稀释待测噬菌体文库；3）待 TG1 培养物达到对数中期时，将其 200 L 等分于 1.5 mL离心管中，每个稀释梯度一管；4）每管加入 10 L 的不同稀释

21、度的噬菌体，快速振荡混匀，37 温育 10 min，5）将孵育后产物涂布于 SOB-AG 平板上，37 倒置培养过夜。6）计算平板上的单菌落数，计算噬菌体文库的滴度；7）取 10 L 噬菌体涂布平板，37 培养过夜，看是否有菌落生长。4.2.10筛选靶分子鼠IgG的纯化1）收集 1 mL 小鼠腹水，4 10000 rpm 离心 10 min，除去沉淀，将上清用0.45 m 滤膜过滤，除去不溶性的小颗粒。2）取 1.5 mL Protein G Sepharose 加入到层析柱中，用 10 倍体积的 PBS 进行过柱洗涤，注意液面，加上塞子，防止树脂暴露于空气中干燥。3）加入 0.5 mL 过滤

22、后的小鼠腹水与 0.5 mL PBS 混匀，盖上盖、塞后室温轻轻混匀 15 min，然后除去盖、塞，让液体流出。4）加入 10 倍体积的PBS洗涤层析柱中树脂。5）加入 1 mL 0.1 M Gly-HCl（pH2.5）洗脱缓冲液，过柱洗脱，收集洗脱液，迅速加入适量的 1 M Tris-HCl(pH9.0) 中和缓冲液进行中和。6）将获得的 IgG 洗脱液进行 SDS-PAGE 分析其纯度和浓度。4.2.11 IgG 结合力减弱文库 A 的淘选1）用 PBS 稀释 IgG 至终浓度为 5 g /mL，按100 L/孔 加入酶标孔中，4包被过夜。2）PBST 洗涤 3 次，加入 2% BSA 3

23、7 封闭 2 h。3）PBST 洗涤 3 次，加入 100 L PHEN-mtGB2 噬菌体展示文库，噬菌体数量为1011 cfu，37 孵育1.5 h。4） 用 pH6.0 的 PBS 洗涤缓冲液洗涤 3 次，然后加入 300 L 该缓冲液，37 12 min。5）用 pH6.0 的 PBS 洗涤缓冲液洗涤 10 次，加入 200 L pH4.0 的 Gly-HCl 洗脱缓冲液，37 孵育 25 min，将该洗脱缓冲液转移至一无菌离心管中，用中和缓冲液中和。6）取 10 L 进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余则加入至 1 mL TG1对数期培养物进行感染，37 孵育1 h ，保存备

24、用进行文库的扩增。7）将文库扩增结果进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表4-2。表4-2 亲和力减弱文库 A（pH4.0-6.0）各轮的淘选条件Tab.4-2 The panning condition of each rounds of the library A (pH4.0-6.0) 轮次IgG包被量（g）文库投入量(cfu)洗涤时间（min）洗脱时间（min）10.51.01011122520.251.01011152530.12.01010202040.11.0101020154.2.12 IgG 结合增强文库 B 的淘选1）用 PBS 稀释 IgG 至终浓度为 5 g

25、/mL，按 100 L/孔 加入酶标孔中，4 包被过夜。2）PBST 洗涤 3 次，加入 2% BSA 37 封闭 2 h。3）PBST 洗涤 3 次，加入100 L pHEN-mtGB2 噬菌体展示文库，噬菌体数量为 1011 cfu，37 孵育 1.5 h。4）用 pH 7.0 的 PBST 洗涤缓冲液洗涤10次。5）用 0.1 M Gly-HCl（pH2.4）洗涤缓冲液洗涤 3 次，加入 300 L 该缓冲液，37 孵育 12 min，再用0.1M Gly-HCl（pH2.4）洗涤缓冲液洗涤 3 次，然后用pH7.0 的PBST 洗涤缓冲液洗涤 3 次。6）加入 200 L TG1 对数

26、期培养物，37 感染 1 h。7）取出感染后 TG1 培养物，取 10 L 进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余则进行文库的扩增。8）将扩增后文库进行下一轮淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表4-3。表4-3 亲和力减弱文库 B（pHpH2.4）各轮的淘选条件Tab.4-3 The panning condition of each rounds of the library B (pHpH2.4)轮次IgG包被量（g）文库投入量（cfu）洗涤时间（min）10.51.010111220.252.010101530.15.01092040.15.0109254.2.13 淘选后文库的

27、扩增1） 将文库感染物产物加入至 3 mL 2YT-G 培养基中，37、225 rpm 振荡培养 1 h，加入 Amp 至终浓度为 100 ng/mL，同时按 cell：phage = 1：20的比例加入 M13K07 噬菌体，37、225 rpm振荡培养 2 h。2） 将培养物分装于离心管中，1000 rpm，5 min，收集菌体，加入至 20 mL 2YT-AK 培养液中，30，250 rpm 振荡培养过夜。3）将过夜培养物 10000 rpm 离心 20 min，收集上清，每 5 mL上清中加入1 mL PEG/NaCl，混匀后置于 4 1 h 以上，最好是过夜。4）10000 rpm，

28、20 min，去除上清，将沉淀重悬于 2 mL TBS 中，加入 1/5 体积的 PEG/NaCl，混匀后置于 4 1 h 以上。5）10000 rpm，20 min，去除上清，将沉淀悬浮于400 L TBS-1%BSA中，即为该轮淘选后文库，测定滴度，用于下一轮淘选或者分析。4.3实验结果4.3.1野生型pHEN I-GB2质粒的构建通过 Nco I 和 Xho I 将野生型 wtGB2 克隆至 pHEN I 中，菌落 PCR 验证后提取阳性克隆子的质粒，用 Nco I 和 Xho I 进行双酶切验证，结果获得两条带，分别与空载体和外源片段大小一致，说明载体构建成功（图4-4）。进一步经测序

29、确正，未发现突变。图4-4 pHEN I-wtGB2 重组质粒的 Nco I 和 Xho I 双酶切验证图Fig.4-4 Identification of the pHENI-wtGB2 by restriction enzyme of Nco I and Xho IM1:-Hind digest DNA marker； M2:DL2000 marker； 1: pHEN I噬菌粒双酶切样品； 2: pHEN I-wtGB2 重组噬菌粒双酶切样品；3: mtGB2 DNA片段双酶切样品4.3.2 GB2的随机突变以 pHEN I-wtGB2 重组噬菌粒为模板，pHEN-F 和 pHEN-R

30、为引物，采用易错 PCR 方法对 GB2 进行随机突变，分四管进行，四管分别将一种脱氧核苷酸的浓度降低 90%，每个反应都进行 35 个循环。1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析，四个反应均成功进行，产物浓度、大小也一致（见图4-5）。 图4-5 易错 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.4-5 Analysis of the error-PCR products M：DL2000 Marker；1、2、3、4：分别为减少 90% 的dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP 的易错PCR扩增产物；将 4 管易错 PCR 产物混合，经乙醇沉淀浓缩纯化，取部分进行 TA 克隆，经菌落 PCR 验证后，挑取 4 个克隆子送测序，用 DNASTAR 软件将其与野生型 GB2 片段进行比较，分析随机突变情况。由图 4-6可以看出共发生了 29 处点突变，突变率约为1.93%。随机突变位点的分布位置是随机的，没有出现突变热点。就突变碱基而言，主要是 A、T 发生突变，占了约 82%，突变结果表现出了一定的偏向性。图4-6 随机突变产物的氨基酸突变结果分析图Fig.4-6 Comparison of the amino acid sequences between wtGB2 and four mtGB2 clones from error-PCR黄色：发生点突变；红色：未发生点突变