高通量测序技术简介_精品文档.pptx

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高通量测序技术简介,高通量测序技术简介,高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

目前用于微生物群落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的454法、Illumina公司Solexa法和ABI的SOLiD法,罗氏454法测序原理,GSFLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。

在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。

通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。

罗氏454法测序流程,样品DNA打断：

样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段加接头：

借助一系列标准的分子生物学技术，将3端和5端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。

接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到一条DNA片段=一个磁珠：

接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。

一个磁珠=一条读长：

经过emPCR扩增后富集，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。

Solexa测序法原理,Solexa测序技术其的核心思想感是边合成边测序。

即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应崔化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时，释放出荧光信号。

通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。

Solexa测序法测序流程,1.添加接头：

利用物理方法将待测样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端加上接头,表面结合：

Solexa的测序时利用微注射系统将已经加过接头和待测片断随机添加到玻璃FlowCell内，每一个FlowCell又补分成8条Lane，每条Lane的内表面上能与共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片断,3.桥型扩增循环获得多拷贝待测DNA片断:

在Flowcell内加入未被标记的dNTP和酶起始固相桥型扩增。

所有单链桥型待测片段被扩增成双链桥片断，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。

通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片断。

四种荧光标记的染料应用边合成边测序（SequencingBySynthesis）的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。

互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。

多余的核苷被移走。

这样每个单链DNA分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。

针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。

荧光信号被CCD采集，CCD快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。

通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。

SOLiD测序法简介,SOLiD全称为supportedoligoligationdetetion，它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。

三种测序法比较,3个平台的测序方法虽然各具特点，但在原理上有很多的共同之处主要表现为:

可将目标DNA剪切为小片段;单个小片段DNA分子结合到固相表面;进行单分子独立扩增;每次只复制一次并检测信号;具有高分辨率的成像系统;高的输出量和高解析度。

高通量测序技术在宏基因组学中的应用,基于16SrRNA的微生物群落分析基于宏基因组的功能基因分析基于宏转录组的群落转录调控规律分析单细胞分离及宏基因组研究,Thankyou!