分子生物学检查7版_精品文档.ppt

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分子生物学检查南方医院实验诊断学教研室温淑娟11基因诊断基因诊断22流式细胞术及其临床应用流式细胞术及其临床应用33染色体检测染色体检测11基因诊断基因诊断一、基因诊断在实验诊断中的位置一、基因诊断在实验诊断中的位置二、基因诊断在临床诊断中的必要性二、基因诊断在临床诊断中的必要性三、基因诊断的原理、途径三、基因诊断的原理、途径四、基因诊断在临床医学中的应用四、基因诊断在临床医学中的应用临床医学实验诊断技术的发展临床医学实验诊断技术的发展细胞形态学技术细胞形态学技术（细胞形态和细胞形态和/或数量或数量）生化检验技术生化检验技术（生物化学代谢产物和酶生物化学代谢产物和酶）免疫学诊断技术免疫学诊断技术（识别特定蛋白质分子的差异识别特定蛋白质分子的差异）分子诊断技术分子诊断技术（DNA/RNA和蛋白质和蛋白质）基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置基因诊断的检测对象和其在诊断中的位置转录转录翻译翻译分泌和表达分泌和表达DNA核膜核膜mRNA蛋白蛋白细胞膜功细胞膜功临床临床能性产物能性产物表现表现核酸诊断核酸诊断生化诊断生化诊断血清学诊断血清学诊断临床诊断临床诊断（基因诊断）（基因诊断）（酶法测定）（酶法测定）（血清蛋白）（血清蛋白）基因诊断可以更早基因诊断可以更早、更本质地反映生理更本质地反映生理、病理状况病理状况基因诊断的实验诊断对象基因诊断的实验诊断对象先天遗传性疾患先天遗传性疾患后天基因突变引起的疾病后天基因突变引起的疾病外源基因侵入致病外源基因侵入致病基因诊断的原理基因诊断的原理运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查运用现代分子生物学和分子遗传学方法检查基因的结构及其表达功能是否正常，从而对疾病基因的结构及其表达功能是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。

作出诊断的方法。

基因诊断的途径基因诊断的途径基因突变的检测基因突变的检测,基因连锁分析基因连锁分析,基因表达分析基因表达分析基因诊断的优点基因诊断的优点病因诊断，针对性强；快速；灵敏；特异性高病因诊断，针对性强；快速；灵敏；特异性高基因诊断的必要性基因诊断的必要性-不可替代不可替代基因诊断的常用技术基因诊断的常用技术一、一、聚合酶链式反应聚合酶链式反应二、二、DNADNA测序测序三、核酸分子杂交技术三、核酸分子杂交技术四、单链构象多态性分析四、单链构象多态性分析五、单核苷酸多态性分析五、单核苷酸多态性分析六、连接酶链式反应六、连接酶链式反应七、基因芯片技术七、基因芯片技术聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）PCR）8PCRPCR？

8PCRPCR的原理的原理8PCRPCR的技术特点的技术特点?

反转录反转录PCRPCR?

荧光荧光PCRPCRPCRPCR在临床医学中的应用在临床医学中的应用PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应是模拟DNA体内复制过程，在DNA聚合酶作用下，进行特定DNA片段的体外复制。

PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸55553333变性、变性、变性、变性、复性复性复性复性变性、变性、变性、变性、复性复性复性复性PCRPCR的技术特点的技术特点l特异性强特异性强（几乎没有方法学的假阳性几乎没有方法学的假阳性）l灵敏度高灵敏度高l简便快速简便快速l对样品要求低对样品要求低lPCRPCR的局限性的局限性RT-PCR（RT-PCR（反转录反转录-PCR）PCR）（reversetranscription-PCRreversetranscription-PCR）模板选用的是模板选用的是RNARNA通过逆转录酶聚合而成的通过逆转录酶聚合而成的cDNAcDNA模板模板cDNAcDNA是一条单链，在反义引物的引导下合成第二是一条单链，在反义引物的引导下合成第二链模板链模板DNADNA，此时才开始常规的，此时才开始常规的PCRPCR扩增扩增在在RT-PCRRT-PCR中，模板量及所抽提的中，模板量及所抽提的RNARNA极其重要极其重要可进行一步可进行一步RT-PCRRT-PCR或两步或两步RT-PCR（RT-PCR（巢式或半巢式）巢式或半巢式）病病原原体体DNARNAPCR裂解裂解抽提抽提扩扩增增产产物物检检测测核酸核酸纯化化PCRPCR检测流程检测流程RT-PCR凝胶电泳凝胶电泳酶切分析酶切分析杂交杂交核酸序列分析核酸序列分析PCRPCR扩增及产物分析扩增及产物分析PCRPCR产物电泳图产物电泳图p1234Marker270bpOligo1:

FluoresceinOligo2:

LCRed640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量传递（FRETProbeFRETProbe）RQ53535353ExcitationRQQRQRExcitation双标记探针（双标记探针（TaqmanProbeTaqmanProbe）FQ-PCR反应原理反应原理特异性特异性荧光光双双标记探探针Taq酶5353外外切切酶活性活性荧光PCR仪FQ-PCRFQ-PCR实时动力学曲线实时动力学曲线FQ-PCRFQ-PCR的技术特点的技术特点C封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性性C可定量检测，扩展了临床应用空间可定量检测，扩展了临床应用空间C光谱技术进一步提高了灵敏度光谱技术进一步提高了灵敏度可检测单拷贝基因可检测单拷贝基因C荧光探针杂交，进一步提高了特异性荧光探针杂交，进一步提高了特异性C扩增与自动分析一体化，检测更加简便快速扩增与自动分析一体化，检测更加简便快速PCRPCR在临床医学中的应用在临床医学中的应用早期诊断早期诊断病情评估和预后判断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证新药验证输血源的筛选输血源的筛选母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交？

核酸分子杂交？

常用的常用的核酸分子杂交技术及应用核酸分子杂交技术及应用常用的常用的核酸分子杂交技术及应用核酸分子杂交技术及应用Southern印迹杂交印迹杂交-DNA印迹印迹Northern印迹杂交印迹杂交-研究研究RNA的方法的方法斑点杂交斑点杂交-狭缝杂交。

狭缝杂交。

DNA、RNA均可检测均可检测原位杂交原位杂交-检测检测DNA或或RNA同时还可对其进同时还可对其进行细胞及基因组内定位行细胞及基因组内定位单核苷酸多态性单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism）SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNADNA序列多态性。

序列多态性。

SNPSNP在人类基因组中广泛存在。

是人类可遗传的变在人类基因组中广泛存在。

是人类可遗传的变异中最常见的一种。

异中最常见的一种。

基因芯片技术逐步应用于基因芯片技术逐步应用于SNPSNP检测，使大规模进行检测，使大规模进行SNPSNP检测成为可能。

检测成为可能。

SNPSNP的意义和应用的意义和应用1.疾病连锁分析和未知致病基因的定位疾病连锁分析和未知致病基因的定位2.疾病的关联分析疾病的关联分析3.复杂疾病或过程的基因定位复杂疾病或过程的基因定位4.法医学应用法医学应用5.疾病疾病发生的分子生的分子遗传机制的机制的阐明明环境因子境因子6.易感基因的易感基因的检出出7.药物基因物基因组学研究学研究8.器官移植配型和物种器官移植配型和物种进化的研究化的研究基因芯片基因芯片GeneChipGeneChip原理原理：

是将大量寡核苷酸分子固定于支：

是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。

的数量。

基因芯片技术的应用基因芯片技术的应用1.优生方面：

避免许多遗传病的发生优生方面：

避免许多遗传病的发生2.疾病诊断方面：

疾病诊断方面：

3.器官移植、组织移植、细胞移植方面的基器官移植、组织移植、细胞移植方面的基因配型因配型4.病原体诊断病原体诊断2流式细胞术及其临床应用流式细胞术及其临床应用流式细胞术流式细胞术流式细胞仪组成及其工作原理流式细胞仪组成及其工作原理流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用流式细胞技术流式细胞技术l流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态流式细胞技术是在流体状态下观察细胞状态的一种技术的一种技术l能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测行定性或定量检测l分类收集细胞分类收集细胞流式细胞仪流式细胞仪1.流动室和液流系统流动室和液流系统2.激光源和光学系统激光源和光学系统3.光电管和检测系统光电管和检测系统4.计算机和分析系统计算机和分析系统5.细胞分离纯化系统细胞分离纯化系统（有细胞分选功能时有细胞分选功能时）流式细胞技术工作示意图流式细胞仪流式细胞术的临床应用流式细胞术的临床应用1免疫学免疫学：

免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细：

免疫活性细胞的分型与纯化、淋巴细胞亚群与疾病关系的分析、免疫缺陷病的诊断、胞亚群与疾病关系的分析、免疫缺陷病的诊断、器官移植后的免疫学监测器官移植后的免疫学监测2血液学血液学：

白血病的免疫分型已成为诊断血液恶：

白血病的免疫分型已成为诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要标准之一性肿瘤不可缺少的重要标准之一3肿瘤学肿瘤学：

鉴别良恶性肿瘤，预测预后，评估化：

鉴别良恶性肿瘤，预测预后，评估化疗药疗效疗药疗效4分子生物学分子生物学:

可在单细胞水平进行基因的表达、可在单细胞水平进行基因的表达、调控及功能研究。

调控及功能研究。

3染色体检查染色体检查染色体检查在临床医学上的意义染色体检查在临床医学上的意义11、判定男女、判定男女3染色体检查染色体检查染色体检查在临床医学上的意义染色体检查在临床医学上的意义11、判定男女、判定男女22、诊断遗传病、诊断遗传病33、优生优育、优生优育44、有助于白血病的诊断和分型、有助于白血病的诊断和分型正常女性核型图染色体检查的基本步骤染色体检查的基本步骤取材：

主要采取外周血白细胞、皮肤组织、绒取材：

主要采取外周血白细胞、皮肤组织、绒毛组织、羊水细胞、骨髓毛组织、羊水细胞、骨髓细胞培养：

加入丝裂原获分裂细胞，制成染色细胞培养：

加入丝裂原获分裂细胞，制成染色体标本体标本显微镜下进行初步的染色体观察和分析照相并显微镜下进行初步的染色体观察和分析照相并进行核型分析进行核型分析讨论分析结果并作出诊断报告讨论分析结果并作出诊断报告染染色色体体图图象象分分析析系系统统人类染色体数目或结构畸变导致的遗人类染色体数目或结构畸变导致的遗传性疾病称染色体病。

传性疾病称染色体病。

共同的临床特征共同的临床特征：

先天性多发畸形、智力低下、生长发育迟先天性多发畸形、智力低下、生长发育迟缓和皮肤纹理改变。

性染色体异常的患着还缓和皮肤纹理改变。

性染色体异常的患着还将出现内、外生殖器异常或畸形。

将出现内、外生殖器异常或畸形。

先天愚型核型图先先天天愚愚型型患患者者Turner综合征核型图Turner综合征患者4P三体综合征4P三体综合征