“从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案_精品文档.ppt

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神经生物学科研中心分子生物学平台张宝乐“从从RNARNA提取到荧光定量提取到荧光定量PCR”PCR”的的解决方案解决方案一、RNA提取及反转录样品收集样品收集提取RNA的样品要保证“新鲜”（屠宰后，立即放入液氮，过夜后转入-80冰箱）RNA提取提取防止RNA酶的污染：

DEPC处理150-180烘烤3-4huTrizol-氯仿（氯仿氯仿（氯仿-异戊醇异戊醇49:

1）-异丙醇异丙醇-75%乙醇乙醇u试剂盒（离心柱滤膜吸附法）试剂盒（离心柱滤膜吸附法）提取方法：

RNA检测检测u甲醛变性电泳:

三条带（28、18、5.8/5S）u紫外吸光值检测：

OD260/280（1.8-2.0）（1.7蛋白质或酚污染；2.1异硫氰酸残存或降解）OD260读数（0.1-0.5）（线性关系好）RNA得率=OD260*稀释倍数*40ng/l反转录反转录u模版：

总RNA、mRNA、体外转录的RNAu引物:

oligo（dT）、随机引物、基因特异引物（GSP）u反转录酶：

u防止防止RNA二级结构导致的反转录失败：

二级结构导致的反转录失败：

RNA655min，冰上3-5min，立即立即42反转录加入氢氧化甲基汞（CH3HgOH）或解链蛋白使用耐受高温（55-65）的反转录酶反转录检测反转录检测利用内参基因内参基因检测反转录效果，如GAPDH,-actin等。

利用普通利用普通PCR初筛定量引物初筛定量引物u特异性、避免产生引物二聚体u产物长度90-300bp之间u退火温度：

60左右（内参和目的基因一致）u考虑目标剪接体（若基因存在可变剪切）u尽量跨内含子设计引物Real-timePCR检测检测确定引物的有效性（扩增曲线、熔解曲线、标准曲线）二、Real-timePCR荧光定量PCR原理常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是是基线（背景）荧光信号的基线（背景）荧光信号的标准偏差的标准偏差的10倍倍。

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。

NOTE:

采用采用72延伸延伸时采集荧光时采集荧光!

9560左右左右NOTE:

质粒获质粒获得后，用限制得后，用限制性内切酶单酶性内切酶单酶切，使其线性切，使其线性化！

化！

或者使用纯化或者使用纯化的的PCR产物。

产物。

NOTE:

稀释液可采用专用的定量稀释液可采用专用的定量PCR稀释液，如稀释液，如EASYDILUTION标准曲线的线性关系不佳标准曲线的线性关系不佳可能的原因可能的原因：

1.1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；2.2.标准品降解：

标准品尽量避免反复冻融；标准品降解：

标准品尽量避免反复冻融；3.3.引物或探针不佳：

重新设计；引物或探针不佳：

重新设计；4.4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

模板中存在抑制物，或模板浓度过高。

PCR过程中经常出现的几个问题分析Ct值出现过晚值出现过晚（30）：

u阈值设计过高；阈值设计过高；u反应条件不佳：

未最佳反应条件，可重新设计引物或反应条件不佳：

未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；uPCR各种反应成分的降解或加样量不够；各种反应成分的降解或加样量不够；u扩增产物片段过长：

一般采用扩增产物片段过长：

一般采用100200bp的扩增长度。

的扩增长度。

阴性对照出现明显的扩增：

阴性对照出现明显的扩增：

u荧光荧光PCRmix或水被污染；或水被污染；u气溶胶的干扰；气溶胶的干扰；u引物二聚体的出现：

引物二聚体的出现：

在在35循环后阴性对照出现扩增属循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析正常情况，可配合溶解曲线进行分析。

PCR结果的结果的重复性不好：

重复性不好：

u加样不准确；加样不准确；u仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；u模板浓度低：

样品初始浓度越低，重复性越差，应减模板浓度低：

样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

少样品的稀释倍数。

扩增效率低：

扩增效率低：

u反应试剂中部分成分特别是反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解荧光染料降解；u反应条件不佳：

适当降低退火温度或改为三步扩增反应条件不佳：

适当降低退火温度或改为三步扩增法；法；u反应体系中有抑制物：

一般为模板中引入，应先把反应体系中有抑制物：

一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。

模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。

荧光定量荧光定量PCRCt值一般在多少后认值一般在多少后认为模板没扩增：

为模板没扩增：

u当进入对数期的循环数大于当进入对数期的循环数大于35时，时，RealtimeRT-PCR检测无效，基因没有表达；检测无效，基因没有表达；u当进入对数的循环数在当进入对数的循环数在32-35个循环时，需要有至少个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表达。

个重复才能判断是否能检测到基因的表达。

Theend！

Thankyou！