响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺研究报告文档格式.docx
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3结果与分析3
3.1葡萄糖标准曲线绘制3
3.2单因素实验结果与分析3
3.2.1液料比对北芪菇多糖提取率的影响3
3.2.2提取时间对北芪菇多糖提取率的影响4
3.2.3温度对北芪菇多糖提取率的影响5
3.3响应面设计实验结果与分析5
3.3.1响应面分析因素水平的选取5
3.3.2响应面分析实验设计方案及结果5
3.3.3多元二次响应面回归模型的建立与分析6
3.3.4最佳提取条件的确定7
4结论与讨论7
4.1结论7
4.2讨论10
参考文献10
致谢13
1引言
北芪菇是根据山西省大同市浑源县特殊的地理气候优势，依据传统中医药“药食同源”的理论，用北岳恒山正宗黄芪和多种中草药及农作物副产品作培养料加工培育而成的一种营养价值极高的新型食用菌。
北芪菇为药食同用的功能型产品，经测定[1-5]其有效成分为：
氨基酸，多糖，生物碱，并含有多种维生素和无机盐类物质。
特别是，北芪菇内含有特殊功能的高倍量硒化物多糖，是普通蘑菇所没有的。
对反复发作的牛皮癣患者有特殊效果[6]。
目前，关于北芪菇多糖提取工艺的研究多为在单因素实验的基础上进行正交实验，用响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺的研究却少见报道，因此本研究主要采用响应面分析法对北芪菇多糖提取工艺进行优化，主要方法是水回流提取多糖，并用苯酚—硫酸法测定北芪菇的多糖含量，对温度、时间、液料比进行单因素实验[7]，根据box-benhnken的中心组合实验原理，确定响应面实验方案，做出响应面实验结果，结果通过Design-Expert软件程序进行分析[8-10]，从而确定最佳提取条件，旨在为今后北芪菇多糖的更深入研究与开发利用提供理论基础。
2材料与方法
2.1材料、试剂与仪器
材料：
北芪菇购买于山西省浑源县恒山北芪菇专业合作社。
试剂：
95%乙醇，无水乙醇，无水乙醚，丙酮，三氯甲烷，浓硫酸，苯酚，葡萄糖，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。
仪器：
数显恒温水浴锅HH—6<
国华电器有限公司）、食品粉碎机<
福州金熊电器有限公司）、Mar-80台式大容量离心机<
常州国华电器有限公司）、070MBE电热鼓风干燥箱<
上海博讯实业有限公司）、E-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂>
、HB-Ⅲ旋转水式多用真空泵<
郑州长城科工贸有限公司）、752型紫外分光光度计<
上海光谱仪器有限公司）、35目筛、烧杯、量筒、三角瓶、玻璃杯、移液管、离心管、容量瓶等。
2.2实验方法
2.2.1多糖的提取工艺流程
将北芪菇粉碎→过35目筛→水浴回流→离心<
4000r/min、15min），取上清液→沉淀水浴回流再次离心[11,12]→合并两次上清液→减压浓缩至10mL左右→用的Sevage试剂<
三氯甲烷:
正丁醇体积比=4:
1）除蛋白[13]<
糖液:
Sevage=5:
1）→离心，取上清液→加入4倍95%的乙醇沉淀<
使乙醇浓度为80%）→静置过夜→离心→得到沉淀→无水乙醇，丙酮，无水乙醚洗涤[14]→60℃恒温干燥→粗多糖。
2.2.2多糖含量的测定
多糖含量的测定采用苯酚—硫酸法，多糖在浓硫酸的作用下迅速水解成单糖，然后生成糠醛衍生物，与苯酚结合生成橙黄色化合物，其呈色强度与溶液中糖的浓度成正比。
由于苯酚是显色的关键，5%苯酚溶液不稳定极易被氧化，需重蒸馏并现配现用，具体做法如下：
取苯酚80g，NaOH0.1g，蒸馏收集182℃时的馏分，准确称取重蒸馏苯酚5g，加适量蒸馏水溶解后，转至100mL容量瓶用水定容，摇匀后置于棕色瓶内冷藏备用。
2.2.3多糖提取率的计算
多糖提取率<
%）=CD/W×
100%，式中C—样品溶液中葡萄糖的含量<
μg/mL）；
D—样品溶液稀释倍数<
mL）；
W—北芪菇样品的质量<
μg）。
2.2.4多糖提取实验的设计
（1>
葡萄糖标准曲线的制备
葡萄糖标准溶液的配制[15-18]：
准确称量105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品10mg，置于100mL的烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，转至100mL容量瓶中，以蒸馏水定容，即得浓度为100μg/mL葡萄糖标准液。
取7支试管，按表1数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液。
在每支试管中，加入5%的苯酚0.5mL，然后加入浓硫酸5mL，迅速置于冰水浴中冷却。
各管加完后室温放置20min，在490nm波长下比色。
表1不同浓度的葡萄糖溶液
Table1Differentconcentrationsofglucosesolution
管号
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液/mL
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8
蒸馏水/mL
1.0
0.9
0.7
葡萄糖含量/μg
10
20
30
40
60
80
（2>
单因素实验:
以北芪菇多糖提取率为指标，研究液料比、提取温度、提取时间对北芪菇多糖提取率的影响。
液料比：
取经粉碎过35目筛的北芪菇粉末1g于圆底烧瓶中，按液料比10:
1，20:
1，30:
1，40:
1，50:
1，分别加入蒸馏水10mL，20mL，30mL，40mL，50mL，90℃条件下回流提取2h，提取2次。
提取温度：
取经粉碎过35目筛的北芪菇粉末1g于圆底烧瓶中，在液料比30:
1的条件下，分别在温度为60℃，70℃，80℃，90℃，100℃的水浴锅中，回流提取2h，提取2次。
提取时间：
1及温度90℃的条件下，分别回流提取1h，1.5h，2h，2.5h，3h，提取2次。
（3>
响应面实验：
根据单因素实验结果，以多糖提取率为参考指标，选取提取温度，时间，液料比三项为考察因素，各取三个水平，运用Design-Expert软件进行响应面实验设计，设计出响应面实验，根据设计出的实验结果来分析确定北芪菇多糖的最佳提取工艺条件，并对最优条件进行验证实验。
3结果与分析
3.1葡萄糖标准曲线
不同浓度的葡萄糖溶液吸光值见表2。
表2不同浓度的葡萄糖溶液吸光值
Table2Theabsorbancevaluesofdifferentconcentrationsglucosesolution
葡萄糖浓度<
μg/mL）
吸光度A
0.195
0.271
0.384
0.466
0.65
0.943
根据表2以标准葡萄糖含量<
μg）做横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。
可以作出葡萄糖标准曲线见图1。
图1葡萄糖标准曲线
Fig.1Thestandardcurveofglucose
回归线方程A=0.0109C（μg/mL>
+0.0402，r=0.994。
葡萄糖在20~80μg/mL范围内符合朗伯-比尔定律，具有良好的线性关系。
3.2单因素实验结果与分析
3.2.1液料比对北芪菇多糖提取率的影响
不同液料比多糖提取结果见表3。
以液料比为横坐标，多糖提取率为纵坐标，绘制不同液料比对多糖提取率的影响，如图2所示，随液料比的增加，多糖提取率增加，但在液料比大于30:
1之后，提取率随液料比的增加而下降。
表3不同液料比多糖提取结果
Table3Theresultsofdifferentliquid-solidratio
液料比<
mL/g）
10:
20:
30:
40:
50:
提取率<
%）
2.70
3.31
5.88
5.43
4.54
图2液料比对多糖提取率的影响
Fig.2Effectsofliquid-solidratioonthecontentofpolysaccharides
3.2.2提取时间对北芪菇多糖提取率的影响
不同提取时间多糖提取率结果见表4。
表4不同提取时间多糖提取率结果
Table4Differentextractiontimeextractionyieldresults
时间<
h）
1.5
2.5
3.64
4.61
6.21
5.33
5.12
以提取时间为横坐标，多糖提取率为纵坐标，绘制不同提取时间对多糖提取率的影响，如图3所示，随时间的增加，多糖提取率增加，但提取时间大于2h之后，提取率随提取时间的增加而下降。
图3提取时间对多糖提取率的影响
Fig.3Effectsofextractiontimeonthecontentofpolysaccharides
3.2.3温度对北芪菇多糖提取率的影响
不同提取温度多糖提取率结果见表5。
表5不同提取温度多糖提取率结果
Table5Differentextractiontemperatureextractionyieldresults
温度<
℃）
70
90
100
2.53
3.21
5.76
4.32
4.21
以提取温度为横坐标，多糖提取率为纵坐标，绘制不同提取温度对多糖提取率的影响，如图4所示，随温度的增加，多糖提取率增加，但温度大于80℃之后，提取率温度的增加而下降。
图4提取温度对多糖提取率的影响
Fig.4Effectsofextractiontemperatureonthecontentofpolysaccharides
3.3响应面设计实验结果与分析
3.3.1响应面分析因素水平的选取
根据box-benhnken的中心组合实验原理[19,20]，综合单因素实验结果，选取如表6所示的实验方案及水平进行响应面分析。
表6响应面实验因素及水平
Table6Responsesurfacefactorsandlevel
因素水平
因素
A提取温度﹙℃﹚
B提取时间<
C液料比<
-1
3.3.2响应面分析实验设计方案及结果
以提取温度A，提取时间B，液料比C为自变量，以北芪菇多糖提取率为响应值<
Y），进行响应面分析实验。
实验方案及实验结果见表7。
表7响应面分析方案及实验结果
Table7Responsesurfaceanalysisprogramandtestresults
试管号
提取率
<
A
B
C
4.35
3.25
5.89
4.85
3.83
6.56
8
4.56
9
4.68
11
12
4.73
13
3.68
14
6.32
15
4.03
16
5.93
17
5.78
3.3.3多元二次响应面回归模型的建立与分析
对表7的结果通过Design-Expert软件程序进行二次回归响应面分析，三个因子经过拟合建立多元二次回归响应面回归模型：
Y=6.10-0.014A+0.18B+0.49C-0.72A2-0.82B2-1.14C2+0.24AB+0.12AC+0.048BC，各因素方差分析见表8。
从表8可以看出，该模型是显著的<
P<
0.001），由P值可以知道,方程中C，A2，B2，C2对Y值的影响非常显著,表明实验因子对响应值不是简单的线性关系,二次项对响应值也有很大的关系,交互作用的影响相对较小。
这和该模型回归中的线性和平方项影响显著相对应。
从表8中还可以看出，影响北芪菇多糖提取率的各因素按影响大小排列顺序依次为C（液料比>
、B（提取时间>
、A（提取温度>
，其中液料比达到极显著水平。
根据回归方程得出不同因素的响应面分析图及相应等高线图，见图5～7。
表8二次响应面回归模型方差分析
Table8Analyzeofmeansquare
方差
来源
平方和
SS
自由度
DF
均方
MS
F值
F
Prob
>
模型
14.12
1.57
14.99
0.0009
0.001512
0.014
0.9077
0.27
2.58
0.1521
1.92
18.36
0.0036
A2
2.19
20.90
0.0026
B2
2.83
27.10
0.0012
C2
5.45
52.13
0.0002
AB
0.22
2.11
0.1895
AC
0.055
0.53
0.4910
BC
0.009025
0.086
0.7775
残差
0.73
0.10
失拟值
0.30
0.099
0.91
0.5116
纯误差
0.44
0.11
总和
14.85
图5～7直观地给出了各个因子交互作用的响应面的3D和等值线分析图。
从响应面图可以看出,在所选范围内存在极值,不仅是响应面的最高点,而且也是等值线最小椭圆中心。
3.3.4最佳提取条件的确定
由响应面法分析数据可得北芪菇多糖最佳提取工艺为：
1，理论最佳提取率为6.16078%。
通过三次验证实验，求得平均值为6.71%，该值与理论值相差0.55%。
因此响应面法优化北芪菇多糖提取工艺的方法可行，得出的结果有实际应用价值。
4结论与讨论
4.1结论
通过对温度、时间、液料比的单因素实验，确定响应面实验方案，用Design-Expert软件处理响应面实验结果并得出理论最佳提取条件，然后经过验证性实验证明理论最佳条件下北芪菇多糖提取率最高，从而确定北芪菇最佳提取工艺为：
图5提取时间与提取温度对多糖提取率影响的响应面图
Fig.5Responsesurfaceplotsofextractiontimeandextraction
temperatureonontheyieldofpolysaccharides
图6液料比与提取温度对多糖提取率影响的响应面图
Fig.6Responsesurfaceplotsofwater/dryweightratioandextraction
temperatureontheyieldofpolysaccharides
图7液料比与提取时间对多糖提取率影响的响应面图
Fig.7Responsesurfaceplotsofwater/dryweightratioandextraction
timeontheyieldofpolysaccharides
在用苯酚—硫酸法测定葡萄糖含量时，当加入浓硫酸后，会产生大量的热，所以需要迅速置于冰水浴中冷却降温。
北芪菇除含有多糖外，还会有单糖，蛋白质和少量的脂肪酸等成分，虽然在实验过程中采取了脱脂、去蛋白和多次洗涤，但少量的这些成分还是会影响多糖提取率和多糖纯度，对实验结果有一定的影响。
（4>
图6和图7的响应面3D曲线比较平坦，是由于液料比与温度，液料比与时间之间的相互影响的显著性相对较小。
表8中的P值越小，对Y值的影响就越显著，所以对北芪菇多糖提取率影响最大的因素为液料比。
4.2讨论
正交实验设计只能处理离散水平的数据，而无法确定整个区域因素的最佳组合和响应值的最优值[21]。
响应面分析法克服了正交设计的缺陷，对各个因素水平进行了更加全面的分析，研究了各个因素之间的相互作用。
用响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺，求得的回归方程精度高，可以准确分析出整个区域因素的最佳组合和响应值的最优值，是比正交设计更理想的方法。
水提取多糖的效率不是太高，若用超声波或微波辅助会大大提高提取率，提取速度也会加快，并且节约能源[22]。
其中超声波提取率要远远高于微波，单其提取时间比微波要长，所以对北芪菇多糖提取工艺有待进一步研究，以寻找最佳提取工艺。
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StudyonResponseSurfaceMethodologyOptimizeBeiqiMushroomPolysaccharidesExtractionProcess
Abstract:
Objective:
ThepurposeofthisarticlewasthestudyofBeiqimushroompolysaccharidesextractionprocessandtheoptimumextractionconditions.Thisarticleprovidedmethodologybasisfortheeffectivedevelopmentofnewtypeofediblefungus—Beiqimushro
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