响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺研究报告文档格式.docx

1、3结果与分析33.1 葡萄糖标准曲线绘制33.2 单因素实验结果与分析33.2.1 液料比对北芪菇多糖提取率的影响33.2.2 提取时间对北芪菇多糖提取率的影响43.2.3 温度对北芪菇多糖提取率的影响53.3 响应面设计实验结果与分析53.3.1 响应面分析因素水平的选取53.3.2 响应面分析实验设计方案及结果53.3.3 多元二次响应面回归模型的建立与分析63.3.4 最佳提取条件的确定74结论与讨论74.1结论74.2讨论10参考文献10致谢131引言北芪菇是根据山西省大同市浑源县特殊的地理气候优势，依据传统中医药“药食同源”的理论，用北岳恒山正宗黄芪和多种中草药及农作物副产品作培养料

2、加工培育而成的一种营养价值极高的新型食用菌。北芪菇为药食同用的功能型产品，经测定1-5其有效成分为：氨基酸，多糖，生物碱，并含有多种维生素和无机盐类物质。特别是，北芪菇内含有特殊功能的高倍量硒化物多糖，是普通蘑菇所没有的。对反复发作的牛皮癣患者有特殊效果6。目前，关于北芪菇多糖提取工艺的研究多为在单因素实验的基础上进行正交实验，用响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺的研究却少见报道，因此本研究主要采用响应面分析法对北芪菇多糖提取工艺进行优化，主要方法是水回流提取多糖，并用苯酚硫酸法测定北芪菇的多糖含量，对温度、时间、液料比进行单因素实验7，根据box-benhnken的中心组合实验原理，确定响应

3、面实验方案，做出响应面实验结果，结果通过Design-Expert软件程序进行分析8-10，从而确定最佳提取条件，旨在为今后北芪菇多糖的更深入研究与开发利用提供理论基础。2材料与方法2.1 材料、试剂与仪器材料：北芪菇购买于山西省浑源县恒山北芪菇专业合作社。试剂：95%乙醇，无水乙醇，无水乙醚，丙酮，三氯甲烷，浓硫酸，苯酚，葡萄糖，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。仪器：数显恒温水浴锅HH6国华电器有限公司）、食品粉碎机福州金熊电器有限公司）、Mar-80台式大容量离心机常州国华电器有限公司）、070MBE电热鼓风干燥箱、HB-旋转水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司）、752型紫外分光光

4、度计上海光谱仪器有限公司）、35目筛、烧杯、量筒、三角瓶、玻璃杯、移液管、离心管、容量瓶等。2.2 实验方法2.2.1多糖的提取工艺流程将北芪菇粉碎过35目筛水浴回流离心4000r/min、15min），取上清液沉淀水浴回流再次离心11,12合并两次上清液减压浓缩至10mL左右用的Sevage试剂三氯甲烷:正丁醇体积比=4:1）除蛋白13糖液:Sevage=5:1）离心，取上清液加入4倍95%的乙醇沉淀使乙醇浓度为80%）静置过夜离心得到沉淀无水乙醇，丙酮，无水乙醚洗涤1460恒温干燥粗多糖。2.2.2多糖含量的测定多糖含量的测定采用苯酚硫酸法，多糖在浓硫酸的作用下迅速水解成单糖，然后生成糠醛

5、衍生物，与苯酚结合生成橙黄色化合物，其呈色强度与溶液中糖的浓度成正比。由于苯酚是显色的关键，5%苯酚溶液不稳定极易被氧化，需重蒸馏并现配现用，具体做法如下：取苯酚80g，NaOH0.1g，蒸馏收集182时的馏分，准确称取重蒸馏苯酚5g，加适量蒸馏水溶解后，转至100mL容量瓶用水定容，摇匀后置于棕色瓶内冷藏备用。2.2.3 多糖提取率的计算多糖提取率%）=CD/W100%，式中C样品溶液中葡萄糖的含量g/mL）；D样品溶液稀释倍数mL）；W北芪菇样品的质量葡萄糖标准曲线的制备葡萄糖标准溶液的配制15-18：准确称量105干燥至恒重的葡萄糖标准品10mg，置于100mL的烧杯中，加入少量蒸馏水溶

6、解，转至100mL容量瓶中，以蒸馏水定容，即得浓度为100g/mL葡萄糖标准液。取7支试管，按表1数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液。在每支试管中，加入5%的苯酚0.5mL，然后加入浓硫酸5mL，迅速置于冰水浴中冷却。各管加完后室温放置20min，在490nm波长下比色。表1 不同浓度的葡萄糖溶液Table1Different concentrations of glucose solution管号1234567葡萄糖标准液/mL0.10.20.30.40.60.8蒸馏水/mL1.00.90.7葡萄糖含量/g102030406080（2单因素实验:以北芪菇多糖提取率为指标，研究液料比、提取温度

7、、提取时间对北芪菇多糖提取率的影响。液料比：取经粉碎过35目筛的北芪菇粉末1g于圆底烧瓶中，按液料比10:1，20:1，30:1，40:1，50:1，分别加入蒸馏水10mL，20mL，30mL，40mL，50mL，90条件下回流提取2h，提取2次。提取温度：取经粉碎过35目筛的北芪菇粉末1g于圆底烧瓶中，在液料比30:1的条件下，分别在温度为60，70，80，90，100的水浴锅中，回流提取2h，提取2次。提取时间：1及温度90的条件下，分别回流提取1h，1.5h，2h，2.5h，3h，提取2次。（3响应面实验：根据单因素实验结果，以多糖提取率为参考指标，选取提取温度，时间，液料比三项为考察因

8、素，各取三个水平，运用Design-Expert软件进行响应面实验设计，设计出响应面实验，根据设计出的实验结果来分析确定北芪菇多糖的最佳提取工艺条件，并对最优条件进行验证实验。3结果与分析3.1 葡萄糖标准曲线不同浓度的葡萄糖溶液吸光值见表2。表2 不同浓度的葡萄糖溶液吸光值Table2 The absorbance values of different concentrations glucose solution葡萄糖浓度g/mL）吸光度A0.1950.2710.3840.4660.650.943根据表2以标准葡萄糖含量+0.0402，r=0.994。葡萄糖在2080g/mL范围内符合朗

9、伯-比尔定律，具有良好的线性关系。3.2单因素实验结果与分析3.2.1液料比对北芪菇多糖提取率的影响不同液料比多糖提取结果见表3。以液料比为横坐标，多糖提取率为纵坐标，绘制不同液料比对多糖提取率的影响，如图2所示，随液料比的增加，多糖提取率增加，但在液料比大于30:1之后，提取率随液料比的增加而下降。表3 不同液料比多糖提取结果Table3 The results of different liquid-solid ratio液料比mL/g）10:20:30:40:50:提取率%）2.703.315.885.434.54图2 液料比对多糖提取率的影响Fig.2 Effects of liqui

10、d-solid ratio on the content of polysaccharides3.2.2提取时间对北芪菇多糖提取率的影响不同提取时间多糖提取率结果见表4。表4 不同提取时间多糖提取率结果Table4Different extraction time extraction yield results时间h）1.52.53.644.616.215.335.12以提取时间为横坐标，多糖提取率为纵坐标，绘制不同提取时间对多糖提取率的影响，如图3所示，随时间的增加，多糖提取率增加，但提取时间大于2h之后，提取率随提取时间的增加而下降。图3 提取时间对多糖提取率的影响Fig.3Effect

11、s of extraction time on the content of polysaccharides3.2.3温度对北芪菇多糖提取率的影响不同提取温度多糖提取率结果见表5。表5 不同提取温度多糖提取率结果Table5Different extraction temperature extraction yield results温度）70901002.533.215.764.324.21以提取温度为横坐标，多糖提取率为纵坐标，绘制不同提取温度对多糖提取率的影响，如图4所示，随温度的增加，多糖提取率增加，但温度大于80之后，提取率温度的增加而下降。图4 提取温度对多糖提取率的影响Fig.

12、4 Effects of extraction temperature on the content of polysaccharides3.3 响应面设计实验结果与分析3.3.1响应面分析因素水平的选取根据box-benhnken的中心组合实验原理19,20，综合单因素实验结果，选取如表6所示的实验方案及水平进行响应面分析。表6 响应面实验因素及水平Table6Response surface factors and level因素水平因素A提取温度B提取时间C液料比-13.3.2响应面分析实验设计方案及结果以提取温度A，提取时间B，液料比C为自变量，以北芪菇多糖提取率为响应值Y），进行响应

13、面分析实验。实验方案及实验结果见表7。表7 响应面分析方案及实验结果Table7Response surface analysis program and test results试管号提取率ABC4.353.255.894.853.836.5684.5694.6811124.73133.68146.32154.03165.93175.783.3.3多元二次响应面回归模型的建立与分析对表7的结果通过Design-Expert软件程序进行二次回归响应面分析，三个因子经过拟合建立多元二次回归响应面回归模型：Y=6.10-0.014A+0.18B+0.49C-0.72A2-0.82B2-1.14C2

14、+0.24AB+0.12AC+0.048BC，各因素方差分析见表8。从表8可以看出，该模型是显著的P、B（提取时间、A（提取温度，其中液料比达到极显著水平。根据回归方程得出不同因素的响应面分析图及相应等高线图，见图5 7 。表8 二次响应面回归模型方差分析Table 8 Analyze of mean square方差来源平方和SS自由度DF均方MSF值FProb模型14.121.5714.990.00090.0015120.0140.90770.272.580.15211.9218.360.0036A22.1920.900.0026B22.8327.100.0012C25.4552.130.

15、0002AB0.222.110.1895AC0.0550.530.4910BC0.0090250.0860.7775残差0.730.10失拟值0.300.0990.910.5116纯误差0.440.11总和14.85图5 7直观地给出了各个因子交互作用的响应面的3D 和等值线分析图。从响应面图可以看出, 在所选范围内存在极值, 不仅是响应面的最高点, 而且也是等值线最小椭圆中心。3.3.4最佳提取条件的确定由响应面法分析数据可得北芪菇多糖最佳提取工艺为：1，理论最佳提取率为6.16078%。通过三次验证实验，求得平均值为6.71%，该值与理论值相差0.55%。因此响应面法优化北芪菇多糖提取工艺

16、的方法可行，得出的结果有实际应用价值。4结论与讨论4.1结论 通过对温度、时间、液料比的单因素实验，确定响应面实验方案，用Design-Expert软件处理响应面实验结果并得出理论最佳提取条件，然后经过验证性实验证明理论最佳条件下北芪菇多糖提取率最高，从而确定北芪菇最佳提取工艺为：图5 提取时间与提取温度对多糖提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of extraction time and extractiontemperature on on the yield of polysaccharides图6液料比与提取温度对多糖提取率影响的响应面图Fig

17、.6 Response surface plots of water/dry weight ratio and extractiontemperature on the yield of polysaccharides图7 液料比与提取时间对多糖提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface plots of water/dry weight ratio and extractiontime on the yield of polysaccharides 在用苯酚硫酸法测定葡萄糖含量时，当加入浓硫酸后，会产生大量的热，所以需要迅速置于冰水浴中冷却降温。 北芪菇除含有多糖外，还

18、会有单糖，蛋白质和少量的脂肪酸等成分，虽然在实验过程中采取了脱脂、去蛋白和多次洗涤，但少量的这些成分还是会影响多糖提取率和多糖纯度，对实验结果有一定的影响。（4 图6和图7的响应面3D曲线比较平坦，是由于液料比与温度，液料比与时间之间的相互影响的显著性相对较小。表8中的P值越小，对Y值的影响就越显著，所以对北芪菇多糖提取率影响最大的因素为液料比。4.2讨论 正交实验设计只能处理离散水平的数据，而无法确定整个区域因素的最佳组合和响应值的最优值21。响应面分析法克服了正交设计的缺陷，对各个因素水平进行了更加全面的分析，研究了各个因素之间的相互作用。用响应面分析法优化北芪菇多糖提取工艺，求得的回归方

19、程精度高，可以准确分析出整个区域因素的最佳组合和响应值的最优值，是比正交设计更理想的方法。 水提取多糖的效率不是太高，若用超声波或微波辅助会大大提高提取率，提取速度也会加快，并且节约能源22。其中超声波提取率要远远高于微波，单其提取时间比微波要长，所以对北芪菇多糖提取工艺有待进一步研究，以寻找最佳提取工艺。参考文献1 刘润平. 药食同源“北芪菇”J.农产品加工,2009,11: 15-16.2 叶镇鹏. 山西开发药用菌北芪菇J.天津中医, 1993, 2。 26-27.3 罗幼明. 六种新型食用菌J.湖北林业科技, 1999, 3: 37-39.4 PEI Z J.A study on sur

20、face grinding of 300mm silicon wafers J.International Journal of Machine Tools&Manufacture, 2002, 42: 385-393.5 王润梅, 岳志励, 张永芳. 北芪菇化学成分的初步研究J. 山西大同大学学报, 2018, 28（4: 32-33.6 潘保华, 李彩萍, 贾蕴强. 北芪菇对银屑病疗效的初步研究J. 食用菌, 1994, 6（5 43.7 刘洁,缪晓青.响应面分析法优化莲花蜂花粉多糖提取工艺研究J.食品科学,2018, （14 102-103.8 胡成旭, 侯欣彤, 冯永宁, 等. 响应面

21、法优化云芝多糖提取条件的研究J.食品工业科技, 2007, （7 124-125.9 慕运动. 响应面方法及其在食品工业中的应用J.郑州工程学院学报, 2001, 22（3 91-94.10 Yamazaki, Kushida N, Oguchi A. Kikuchi H, et al. Response Surface Design and Analyses M.New York: Marcel Dekker Inc, 1987.149-205.11 REESE E T, MANDELS M, WHISTLER R L. Methods in carbureted chemistry M.

22、New York: Aeademie Press, 1963:139. 12 MEJBAUM W Z.Uber die bestimmung kleiner pentosemengen, insbesondere in devrivaten der adenylsanreJ.HoPPe-Seylers Z PhysiolChem, 1939, 258: 117-120.13 DUBOIS, M, GILLE K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sgars and related substance

23、s J. Anal Chem, 1956,28: 350-356.14 吴向阳, 茆广华, 仰榴青, 等. 银杏外种皮粗多糖提取工艺研究J. 食品科学, 2006, （10 21-26.15 吕玉光, 杨丽敏, 石春卉. 银耳中多糖的含量测定J. 黑龙江医药科学, 1999, 22（6 32.16 欧阳臻, 李永辉, 宿树兰, 等. 桑叶多糖的含量测定J. 食品科学,2003,24（11.17 吴梧桐. 银耳孢子多糖的分离和分析J. 真菌学报,1982, 1（2 119.18 师勤, 马国玉, 徐珞珊, 等. 比色法测定蒺藜中多糖的含量J. 中国药科大学学报, 1997,28（5 291-29

24、319 费荣昌. 实验设计与数据处理（第四版 M.江南大学教材, 2001: 56-63.20 Box G E P, Hunter W G. Statistics for experiments: an introduction to design, data analysis and model building M.New York: Wiley, 1990: 289-356.21 闫克玉, 高远翔. 响应面分析法优化槐M总黄酮的提取工艺J. 食品的研究与开发, 2009, （9 22-23.22 赖红芳, 黄秀香, 吴志鸿, 等.鸡血藤多糖提取工艺研究J.时珍国医国药,2005, 21（

25、8 1872-1874.Study on Response Surface Methodology Optimize Beiqi Mushroom Polysaccharides Extraction Process Abstract:Objective:The purpose of this article was the study of Beiqi mushroom polysaccharides extraction process and the optimum extraction conditions. This article provided methodology basis for the effective development of new type of edible fungusBeiqi mushro