贵州食品安全地方标准.docx

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贵州食品安全地方标准

贵州省食品安全地方标准

《蔬菜中阿维菌素残留的测定酶联免疫吸附法》

编制说明

（征求意见稿）

北京勤邦生物技术有限公司

1、任务来源

本标准的制定是根据“贵州省重大科技专项计划项目”—“贵州省茶叶、蔬菜质量安全评价、检测、预警与可追溯关键技术研究与应用”项目要求而确定的，同时根据贵州省卫生和计划生育委员会办公室关于同意《贵州苕粉》等25项贵州省食品安全地方标准立项的通知（黔卫计办函〔2015〕94号）文件的通知要求，我单位承担的《茶叶、蔬菜中阿维菌素残留的快速检测酶联免疫吸附法》贵州地方标准于2015年11月获得立项。

2、标准制定的背景和必要性

阿维菌素（avermectin，AVMs）是由链霉菌菌株Strptomycesavermitilis代谢产生的一组大环内酯类抗生素，具有很高的杀虫活性，被誉为是近20年来抗寄生虫药物研究的重大突破。

其结构新颖，作用机制独特，对多种农作物的害螨和害虫具有很高的生物活性，是一种优良的抗生素、杀虫剂、杀螨剂，且具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点。

虽然阿维菌素类药物的作用剂量较小（ng/kg级），但是此类药物的脂溶性高，且具有神经毒性和发育毒性，在动物体内的残留时间长，世界卫生组织（WHO）5级分类标准中将其列为高毒化合物。

世界各国均对蔬菜和水果中的AVMs有着严格的限量规定，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）规定的阿维菌素类药物在水果中的最大残留限量（maximumresiduelimit，MRL）为0.01~0.02mg/L；欧盟规定水果、黄瓜、豆类中的MRL为20μg/kg；2006年日本实施的肯定列表制度规定它在农产品中的MRL值执行一律标准，即10μg/kg；我国也规定了结球甘蓝、菠菜、普通白菜（小油菜除外）、莴苣、芹菜、大白菜、豇豆的MRL为50μg/kg，花椰菜的MRL为500μg/kg，小油菜、菜豆的MRL为100μg/kg，番茄、甜椒、黄瓜的MRL为20μg/kg，茄子的MRL为200μg/kg。

贵州属传统的农业省，农业人口和农业产业比重较大。

近年来，我省充分发挥资源优势，加大农业结构调整力度，突出抓好蔬菜、茶叶等优势特色产业。

蔬菜面积1763万亩，蔬菜已成为我省农业结构调整的支柱产业和农民收入的主要来源。

然而随着我省蔬菜产业的不断发展壮大，质量安全也逐渐凸显。

茶叶、蔬菜中残留的农药会通过食物链进入人体，危害人类健康，而且农产品会因质量安全问题被进口国（地区）拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同，制约我省的经济发展。

因此，加强蔬菜等农产品中阿维菌素等农药的检测和控制是一项刻不容缓的工作。

本项目建立阿维菌素的酶联免疫吸附（ELISA）法，采用特异性强的单克隆抗体，检测灵敏度可达到1μg/kg，对蔬菜样本的最低检测限为5μg/kg，满足FAO/WHO规定的最大残留限量，样本加标回收率为70%~110%，检测结果准确度高，并且该方法具有特异性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备等优点，适合大批量样品的集中快速筛查，可为我省蔬菜等农产品的质量安全监管控制提供技术支撑和重要保障。

3、国家标准、行业标准以及其他省外标准的制定发布情况

在国际标准化组织（ISO）标准体系、国际分析化学师协会（AOAC）标准体系和欧盟标准委员会（CEN）标准体系中，均尚未检索到阿维菌素的检测方法标准；我国标准体系中提供了阿维菌素的检测方法标准14项，其中国家标准10项（GB/T20748-2006、GB/T21319-2007、GB/T21320-2007、GB/T21321-2007、GB/T22953-2008、GB/T22968-2008、GB29695-2013、GB29696-2013、GB23200.20-2016、GB23200.19-2016）、农业部公告3项（农业部781号公告-5-2006、农业部1025号公告-5-2008、农业部1486号公告-5-2010）、出入境检验检疫标准1项（SN/T2661-2010），其中仅有1项标准适用于蔬菜《SN/T2114-2008进出口水果和蔬菜中阿维菌素残留量检测方法液相色谱法》。

该标准采用的液相色谱法操作繁琐耗时，仪器设备昂贵，且需要专业的技术人员，仅适用于实验室检测，在现场监管检测和企业质量内控工作中有其局限性，不能满足我省对蔬菜农产品中阿维菌素的快速检测需求。

4、主要工作过程、主要编制成员、参加成员

1、主要工作过程

该标准由北京勤邦生物技术有限公司（以下简称勤邦生物）组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。

编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面：

（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。

（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已将阿维菌素与羟胺反应得到阿维菌素半抗原；将阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得阿维菌素单克隆抗体；完成抗原抗体筛选、配对，获得最优抗原、抗体稀释倍数组合；建立了酶联免疫吸附法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。

（3）针对蔬菜样品与其他参考资料中样品之间的差异，开展多种蔬菜酶联免疫吸附法的试验，包括白菜、胡萝卜，这是方法的重要步骤和关键环节。

不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出蔬菜样品中阿维菌素的含量。

如：

方法的检测限，对20份空白样本进行检测，以检测结果的平均值加上3倍标准差来确定检测限；方法的准确率，通过对5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg三种浓度添加的蔬菜样本进行检测，得到本检测方法的回收率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠。

（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准样本的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。

2、主要成员、参加成员

序号

标准名称

主要编制成员

参加成员

1

蔬菜中阿维菌素残留的测定酶联免疫吸附法

贵州省农产品质检中心、北京勤邦生物技术有限公司

蔡韬、冯才伟、扶胜、陆洋、袁旭、卢平、李占斌、吴小胜、王震、周雪莉、罗华兰、丁静

五、标准主要内容确定的依据

1、主要技术内容的确定依据

技术内容确定的依据：

方法的检测限为5μg/kg，主要是依据我国政府规定的结球甘蓝、菠菜、普通白菜（小油菜除外）、莴苣、芹菜、大白菜、豇豆的MRL为50μg/kg，花椰菜的MRL为500μg/kg，小油菜、菜豆的MRL为100μg/kg，番茄、甜椒、黄瓜的MRL为20μg/kg，茄子的MRL为200μg/kg。

本方法的检测限，完全能够符合相关部门的要求。

方法的定量限、准确率、特异性等技术指标确定主要依据：

一是《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》的规定要求；二是农业部农牧发〔2003〕1号文件“关于发布《兽药残留试验技术规范（试行）》的通知”中的规定要求；三是按照国际食品法典委员会（CAC）通用要求。

其他参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等主要依据包括：

GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：

标准的结构和编写规则（ISO.IECDirectives,Part3,1997,RulesforstructureanddraftingofInternationalStandard,NEQ）；GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法。

2、标准技术内容和技术指标的论证

2.1酶联免疫吸附法主要材料制备

2.1.1半抗原的合成

阿维菌素是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，需与大分子载体蛋白共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体。

本研究先对阿维菌素小分子进行结构改造获得具有羧基官能团的半抗原，与蛋白质分子中的氨基反应，形成肽键，从而可将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA等）偶联制备人工抗原。

将阿维菌素与羟胺反应得到具有羧基官能团的半抗原，具体操作如下：

阿维菌素与PDC在吡啶催化下60度反应，氧化糖苷中醇羟基为酮，经提取，纯化得到酮基阿维菌素，在与羟胺缩合反应，得到四碳链长度间隔臂的半抗原产物，经核磁鉴定，结构正确，鉴定图谱如下：

图1阿维菌素半抗原结构式鉴定氢谱图

2.1.2抗原的合成

2.1.2.1免疫原的合成

将阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原，具体操作如下：

取5mg阿维菌素半抗原用1mLDMF溶解，取30mgEDC和NHS用0.2mL水充分溶解后加入阿维菌素半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取50mgBSA充分溶解在3.8mLPBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24h；用0.01mol/LPBS于4℃透析3d，每天换液3~4次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。

2.1.2.2包被原的合成

将阿维菌素半抗原与卵清蛋白进行偶联得到包被原，具体操作如下：

取5mg阿维菌素半抗原用1mLDMF溶解，取30mgEDC和NHS用0.2mL水充分溶解后加入阿维菌素半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取50mgOVA充分溶解在3.8mLPBS（pH7.2）中，将反应液A逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌24h；用0.01mol/LPBS于4℃透析3d，每天换液3~4次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用。

2.1.2.3阿维菌素免疫原与包被原的鉴定方法

确定偶联是否成功：

一般通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是否为有效偶联，因为半抗原与蛋白在紫外下有不同的特征吸收，当偶联成功时，偶联物的紫外吸收会有二者的叠加效应出现，因此比单独的蛋白特征吸收会发生一定的偏移，可用于检测偶联是否成功。

偶联比的测定：

用纯水稀释阿维菌素半抗原、BSA、OVA及两种蛋白与阿维菌素半抗原的结合物，配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。

根据公式K=A/CL分别计算出阿维菌素半抗原、BAS、OVA的摩尔消光系数。

在载体蛋白和阿维菌素半抗原的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比：

Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×K阿维菌素264-A偶264×K阿维菌素280）

蛋白含量的测定：

将偶联物稀释到适当倍数后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度：

蛋白质（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260

免疫原和包被原的鉴定结果：

将阿维菌素半抗原、载体蛋白以及两者的结合物配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。

阿维菌素-BSA和阿维菌素-OVA结合比分别为6:

1和8:

1。

2.1.3抗体的制备

2.1.3.1动物免疫

以阿维菌素-BSA作为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠（8~10周龄）。

免疫方案如下：

首免时，每只小鼠用150µg的阿维菌素-BSA（以载体蛋白计）与FCA按1:

3比例混合制成的乳化剂，颈背部皮下多点注射；二免和三免时，将FCA换成FICA，剂量和方法同上。

每次免疫间隔时间为2周。

融合前3天每只小鼠腹腔注入100µg阿维菌素-BSA进行加强免疫。

2.1.3.2单克隆抗体的制备

三免后第7天，采血清测效价。

效价达1.6×105以上的小鼠于四免后第12天，摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。

无菌操作取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合（比例数8:

1）。

融合剂为聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，随后即加入20mL无血清的1640营养液（时间4min）。

离心后，用20mL完全营养液悬浮混匀。

将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中（4板），0.1mL/孔置37℃饱和湿度、含5%CO2的培养箱中培养。

待细胞长至孔底的1/2~1/3时，用间接竞争ELISA方法筛选。

阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。

10~14天后，取细胞上清检测，计算阳性率。

阳性率100%时，得到稳定的细胞株。

采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将BALB/C小鼠（6~8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，10天后，再注入阳性细胞1×106个/只，植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9#针头穿刺腹腔抽取腹水。

每只小鼠可采腹水约2~3mL/次。

离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。

阳性细胞经过3次亚克隆，阳性率达90%，得到了2株稳定分泌单克隆抗体的细胞。

2.2检测方法的建立

2.2.1抗原、抗体的筛选

1）用常规包被液（pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液）将1#、2#、3#抗原分别进行1:

2×104、1:

4×104、1:

8×104稀释，包被酶标板100μL/孔，37℃恒温避光反应2h，PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液（pH7.2，含有5%卵清蛋白，0.1mol/L磷酸盐缓冲液）封闭，37℃恒温避光反应2h，甩干；

2）向板孔中加入标准品溶液（浓度为1μg/L的阿维菌素）100μL；

3）加入用常规抗体稀释液（pH7.2，含有8%牛血清白蛋白，0.1mol/L磷酸盐缓冲液）稀释1:

4×105，1:

6×105，1:

8×105的1#、2#酶结合抗体工作液各100μL，振荡混匀，25℃避光反应30min，用PBST洗液洗板3次；

4）加入底物A液和B液各50μL，25℃反应20min，加入50μL终止液终止；

5）按以上操作方法，分别测定零标准品OD值及1μg/L标准品的OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1.5~2.0，1μg/L标准品抑制率为70%~80%作为评定标准，选择较好的抗原抗体组合和抗原抗体工作浓度[见表1（a）~（b）]。

表1（a）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度

（表格中W表示1×104）

抗体

稀释

倍数

检测

项目

1#抗原

2#抗原

3#抗原

1:

2W

1:

4W

1:

8W

1:

2W

1:

4W

1:

8W

1:

2W

1:

4W

1:

8W

1#

抗体

1:

40W

0μg/L

标准品

OD值

2.442

1.974

1.417

2.902

2.505

2.102

2.164

1.858

1.542

1μg/L标准品

OD值

2.295

1.717

1.204

2.670

2.380

1.766

1.796

1.616

1.480

抑制率（%）

94

87

85

92

95

84

83

87

96

1:

60W

0μg/L

标准品

OD值

1.663

1.438

1.195

2.612

2.294

1.986

1.876

1.653

1.384

1μg/L标准品

OD值

1.430

1.222

1.099

2.429

1.996

1.728

1.613

1.438

1.163

抑制率（%）

86

85

92

93

87

87

86

87

84

1:

80W

0μg/L

标准品

OD值

1.394

1.161

0.974

2.105

1.701

1.517

1.614

1.408

1.179

1μg/L标准品

OD值

1.213

1.103

0.964

1.768

1.446

1.350

1.340

1.197

1.073

抑制率（%）

87

95

99

84

85

89

83

85

91

表1（b）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度

（表格中W表示1×104）

抗体

稀释

倍数

检测

项目

1#抗原

2#抗原

3#抗原

1:

2W

1:

4W

1:

8W

1:

2W

1:

4W

1:

8W

1:

2W

1:

4W

1:

8W

2#

抗体

1:

40W

0μg/L

标准品

OD值

2.806

2.493

2.074

1.953

1.702

1.376

2.017

1.736

1.444

1μg/L标准品

OD值

2.413

2.343

1.763

1.641

1.498

1.293

1.795

1.510

1.199

抑制率（%）

86

94

85

84

88

94

89

87

83

1:

60W

0μg/L

标准品

OD值

2.484

1.946

1.698

1.619

1.455

1.263

1.634

1.418

1.197

1μg/L标准品

OD值

2.260

1.635

1.460

1.360

1.237

1.086

1.340

1.106

1.017

抑制率（%）

91

84

86

84

85

86

82

78

85

1:

80W

0μg/L

标准品

OD值

2.179

1.756

1.375

1.438

1.130

0.907

1.123

0.922

0.628

1μg/L标准品

OD值

1.787

1.335

1.141

1.265

0.938

0.825

0.921

0.774

0.421

抑制率（%）

82

76

83

88

83

91

82

84

67

由表1（a）~（b）可知，1#抗原1:

4×104稀释，2#酶结合物抗体工作液1:

8×105稀释时，零标准品OD值在1.5~2.0之间，1μg/L标准品抑制率为76%，符合要求。

2.2.2反应温度确定

1）包被抗原：

用常规包被液将1#抗原进行1:

4×104稀释，包被酶标板100μL/孔，37℃恒温避光反应2h，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37℃恒温避光反应2h，甩干；

2）加样方式：

向板孔中加入标准品溶液100μL、用常规抗体稀释液稀释1:

8×105的2#酶结合物抗体100μL，混匀，分别在25℃、37℃下避光反应30min，用PBST洗液洗板3次；

3）加入底物A液和B液各50μL，25℃反应15min，加入50μL终止液终止；

4）按照以上操作方法，分别测定零标准品OD值、1μg/L标准品OD值、空白白菜样本OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1.5~2.0，空白蔬菜样本OD值接近零标准品OD值，抑制率在70%~80%为判定标准，选择较好的反应温度（见表2）。

表2反应温度的确定试验

反应温度

零标准品OD值

1μg/L标准品OD值

抑制率（%）

空白白菜OD值

25℃

1.812

1.315

73

1.714

37℃

2.003

1.825

91

1.842

由表2可知，25℃条件下，加入100μL标准品溶液、100μL酶结合物抗体工作液反应后，测定的零标准品OD值在1.5~2.0之间，1μg/L标准品的抑制率在70%~80%之间，空白蔬菜样品的OD值与零标准品OD值偏差较小。

2.2.3抗原、抗体反应时间确定

1）包被抗原：

用常规包被液将1#抗原进行1:

4×104稀释，包被酶标板100μL/孔，37℃恒温避光反应2h，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37℃恒温避光反应2h，甩干；

2）加样方式：

向板孔中加入标准品溶液100μL、用常规抗体稀释液稀释1:

8×105的2#酶结合物抗体工作液100μL，混匀，分别在25℃下避光反应15、30、60min，用PBST洗液洗板3次；

3）加入底物A液和B液各50μL，25℃反应20min，加入50μL终止液终止；

4）按照以上反应方式，测定零标准品OD值，重复两次，每次做6个对照孔，计算不同反应时间测定值的变异度CV%（见表3）。

表3抗原、酶结合物抗体反应时间确定

测定项目

抗原、酶结合物抗体反应时间（min）

15

30

60

第一次

第二次

第一次

第二次

第一次

第二次

OD值

1.400

1.382

1.821

1.711

2.256

2.289

1.596

1.471

1.635

1.815

2.249

2.409

1.028

1.400

1.754

1.772

2.169

2.034

1.116

1.218

1.804

1.840

2.137

2.238

1.367

1.352

1.613

1.790

2.307

2.296

1.402

1.249

1.905

1.815

2.288

2.464

板间CV%

11.7

4.7

5.1

由表3可知，加入标准品100μL、酶结合物抗体工作液100μL，25℃反应30min，零标准品OD值均在1.5~2.0，且变异相对较小

2.2.4底物液显色时间的确定

1）包被抗原：

用常规包被液将1#抗原进行1:

4×104稀释，包被酶标板100μL/孔，37℃恒温避光反应2h，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37℃恒温避光反应2h，甩干；

2）加样方式：

向板孔中加入标准品溶液100μL、用常规抗体稀释液稀释1:

8×105的2#酶结合物抗体工作液100μL，混匀，25℃下避光反应30min，用PBST洗液洗板3次；

3）加入底物A液和B液各50μL，25℃反应10、15、20或30min，加入50μL终止液终止；

4）按照以上反应方式，分别测定零标准品OD值，1μg/L标准品OD值，空白蔬菜样本OD值，计算1μg/L标准品的抑制率，以零标准OD值为1.5~2.0，空白白菜样本OD值接近零标准品OD值，1μg/L标准品抑制率在70%~80%为判定标准，选择底物液显色时间（见表4）。

表4底物液显色时间的筛选试验

显色时间（min）

零标准品OD值

1μg/L标准品OD值

抑制率（%）

空白白菜OD值

10

1.305

0.915

70

1.215

15

1.826

1.406

77

1.803

20

2.287

1.740

76

2.123

由表4可知，底物液显色时间为15min时，零标准品OD值在1.5~2.0之间，空白白菜OD与零标准品OD值偏差较小，1μg/L标准品的抑制率在70%~80%。

2.2.5包被液的筛选

1）包被抗原：

用1#、2#、3#、4#包被液将1#抗原进行1:

4×104稀释，包被酶标板100μL/孔，37℃恒温避光反应2h，用PBST洗液洗涤1次，用常规封闭液封闭，37℃恒温避光反应2h，甩干；

2）加样方式：

向板孔中加入标准品溶液100μL、用常规抗体稀释液稀释1:

8×105的2#酶结合物抗体工作液100μL，混匀，25℃下避光反应30min，用PBST洗液洗板3次；

3）加入底物A液和B液各50μL，25℃反应15m