Rh血型分型试管法试验标准操作规程.docx

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Rh血型分型试管法试验标准操作规程

Rh血型分型试管法试验标准操作规程

（一）检验目的

检测红细胞表面Rh血型系统C、c、D、E、e抗原表达情况，为输血相容性检测、Rh系统新生儿溶血病的诊断与预防等提供参考依据。

（二）检验原理

Rh血型系统单克隆IgM类血型抗体可以使具有相应抗原的红细胞在盐水介质中发生肉眼可见的凝集，利用单克隆IgM血型抗体可以鉴定出红细胞表面的Rh抗原。

（三）适用范围

适用于受检者（受者、供者）红细胞表面C、c、D、E、e抗原鉴定试验。

（四）设备性能参数

参见血清学专用离心机使用说明书。

（五）器材与试剂

1.器材离心机、塑料软试管、塑料硬质试管（75mm×l2mm）、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。

2.试剂生理盐水、市售单克隆IgM抗C、抗c、抗D、抗E、抗e及IgM+IgG抗D标准血清。

IgM抗D用于临床样本（受者）RhD血型的常规检测，不能与DIV细胞反应，不能检测出弱D。

IgM+IgG用于供者样本RhD血型的常规检测及确证试验，能与DIV细胞反应，检测出弱D抗原。

10系或16系谱细胞用于阴阳性对照。

（六）样本要求

1.患者样本EDTA-K2；或EDTA-K3抗凝全血≥3ml，经B600-A型离心机在1760g条件下，离心5分钟，离心后无溶血、无凝块及明显乳糜。

2.供者标本枸橼酸盐抗凝，全血量≥3ml，经B600-A型离心机在1760g条件下，离心5分钟，离心后无溶血、无凝块及明显乳糜。

（七）校准步骤

参照KA-2200血清学专用离心机、B600-A型低速离心机使用说明书中的校准要求执行。

（八）操作程序

1.悬浮红细胞的配制取受检者适量红细胞，经生理盐水洗涤3次，取压积红细胞配成3％～5％的红细胞盐水悬液。

2.加样取4支洁净硬质试管，分别标记为受检者、阴性对照、阳性对照、自身对照，前3支试管内分别加入抗C（或抗c、或抗D、或抗E、或抗e）各1滴，第4支加自身血清（或血浆）2滴，在每支试管中再加配制好待用的3％～5％受检者红细胞悬液1滴，混匀。

3.离心血型血清学专用离心机在1000g条件下，离心15秒。

4.结果判断将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体反复冲刷细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块。

如受检管凝集、阳性对照管凝集、阴性对照管不凝集、自身对照为阴性，即表示C（或c、或D、或E、或e）抗原阳性；受检管不凝集、阳性对照管凝集、阴性对照管不凝集、自身对照为阴性即表示C（或c、或D、或E、或e）抗原阴性。

当出现阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集时，需要更换试剂重复试验。

5.检验结果的输入与确认

（1）启动“检验程序”，输入用户名及口令后，进入检验程序。

（2）单击“检验”菜单，选择“检验结果录入／修改”，通过申请序号进行检验结果的录入及修改。

（3）检验结果的确认：

检验结果应由实验室负责人或授权人员进行确认，方法为单击“结果处理”菜单，选择“报告确认”进人结果确认，通过选择“工作单元”“报告日期”（“单张”或“批量”后，按“提取”键提取已经传输或录入的检验结果，经两人核对无误后按“确认”键进行确认。

（九）质量控制

1.室内质量控制通过增加阳性对照、阴性对照和自身对照实现室内质量控制。

2.室间质量评价目前只有RhD抗原可以参加卫生部临检中心组织的全国输血相容性检测室间质量评价活动，C、c、E、e抗原检测尚无统一的室间质量评价活动可以参力口。

（十）干扰因素

1.离心条件影响试验结果，最好使用血清学专用离心机，以防假阳性或假阴性结果出现。

2.当用未经洗涤的细胞做试验时，样本中的自身凝集和异常蛋白质可能引起假阳性结果。

（十一）结果计算及测量不确定度

不适用。

（十二）生物参考区间

不适用。

（十三）检验结果可报告区间

阳性或阴性。

（十四）警告／危急值

1.-D-患者输注含有C、E、c、e抗原的红细胞，可能会诱发产生抗C、或抗E、或抗c、或抗e抗体。

2.Rhnull型患者输注含有D、C、E、c、e抗原的红细胞，可能会诱发产生抗D、或抗C、或抗E、或抗c、或抗e抗体，造成再次输血时配血困难。

（十五）实验室解释

RhD阴性供者应进一步进行确证试验。

（十六）安全性预警措施

1.实验室及工作人员一般安全防护措施参见《实验室安全与卫生管理制度》。

2.发生血液标本溢出时，应参照《实验室消毒与清洁管理制度》对污染的环境进行消毒处理。

3.操作人员发生职业暴露时，应参照《实验室职业暴露预防与处置管理制度》及时进行相应处理。

4.在仪器运转过程中，勿触及样品针、移动的传输装置等，避免造成人身伤害。

禁止触摸仪器密封面板内的电路，防止造成电击损伤。

5.对突发传染性疾病的血液标本应启动特殊的安全防护程序。

（十七）变异潜在来源

1.D变异体，包括弱D、部分D、放散型D等，都会表现为D抗原减弱。

2.-D／-D-遗传基因型红细胞只有D抗原，缺乏C、E、c、e抗原，其红细胞上D抗原位点比一般红细胞多，抗原活性强。

3.Rhnull型红细胞上测不出Rh抗原，也没有LW抗原，但能产生广谱抗Rh抗体，其红细胞血清能与除Rh.u.以外所有红细胞发生反应。

（十八）Rh血型分型试验特别注意事项

1.Rh抗血清质量应符合要求，用毕后应立即放置4℃冰箱保存，以免细菌繁殖污染。

如出现浑浊或变色则不能使用。

2.试管、滴管必须清洁干燥，防止溶血。

3.严格按照每种试剂的使用说明书进行操作。

（十九）报告时间

Rh血型分型试验，一般于检测当日下午17点前出结果并上传HIS，住院患者的检验报告单由卫生员于次日上午发回申请单所在的临床科室，门诊患者次日于门诊楼一层挂号大厅化验单领取处取检验报告单。

（二十）相关文件

1.抗D、抗C、抗E、抗c、抗e标准血清使用说明书。

2.临床输血技术规范.北京：

中华人民共和国卫生部医政司（2000）。

3.中国输血技术操作规程（血站部分）.天津：

中华人民共和国卫生部医政司（1997）。

ABO及Rh血型抗体效价测定试验标准操作规程

（一）检验目的

检测血清中ABO及Rh血型抗体效价，为新生儿溶血病的诊断和预防、骨髓移植和干细胞移植后供者细胞存活状态评价提供依据。

（二）检验原理

·ABO及Rh血型抗体在一定介质条件下与相应红细胞抗原结合后会出现红细胞凝集，不同的凝集强度会间接反应出血型抗体结合抗原的能力（效价）。

不同标本在血型抗体反应活性均较高的情况下都会使相应红细胞出现最强凝集（4+），无法真正区分不同标本间血型抗体结合抗原的能力差异。

通过将血清（或血浆）连续倍比稀释，观察稀释后血清与相应抗原红细胞凝集反应强度，能够发现不同标本之间血型抗体反应活性的差异或同一受检者不同时期血型抗体反应活性的变化情况。

在确定统一凝集强度的情况下（最后一个1+），产生凝集的最高稀释度的倒数即为该标本的抗体效价。

（三）适用范围

1.ABO血型抗体效价测定①孕妇血型抗体效价检测，用于ABO血型新生儿溶血病风险评估；②骨髓移植、干细胞移植后供者细胞存活状态（嵌合）评价。

2.Rh血型抗体效价测定用于明确产生Rh血型系统不规则抗体的孕妇，以动态评估发生Rh血型新生儿溶血病的风险，主要测定IgG类Rh抗体。

（四）设备性能参数

参见KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生OrthoBioVue离心机使用说明书。

（五）器材与试剂

1.器材血清学专用离心机达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生OrthoBiovue离心机、

塑料软试管、塑料硬质试管（75mm×12mm）、试管架、一次性塑料滴管、移液器、一次性移液枪头、医学专用封口膜、37℃水浴箱等。

2.试剂DiaMedCoombs卡、OthroBiovueCoombs卡、生理盐水、抗IgG抗体试剂（市售单克隆）、凝聚胺试剂、2-Me、致敏的阳性对照细胞（自制）。

（六）样本要求

EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml，经B600-A型离心机1760g条件下离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。

（七）校准步骤

严格参照KA-2200血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID孵育器、强生OrthoBiovue离心机使用说明书执行。

（八）操作程序

1.ABO血型抗体效价测定

（1）IgM类抗体测定

①血清（或血浆）连续倍比稀释：

排列10支试管按顺序编号。

每管用加样枪各加生理盐水100µ1，在第1管中加入待检血清100µl，混匀后移出100µ1转至第2管，以同样操作稀释至第10管，从第10管吸出100µ1暂时保留在另一试管中，以备必要时做进一步稀释。

这样从第1管到第10管的血清稀释度依次是1：

2，1：

4，……1：

1024，移除第10管稀释后的多余的100µ1血清单独保存备用。

②加红细胞悬液：

在每管稀释后的血清（或血浆）各加3％相应红细胞悬液50µ1，混匀（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍比稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液）。

③离心与结果观察：

使用KA-2200台式离心机在1000g条件下，离心15秒后观察结果。

以肉眼观察到最后一个1+的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数即为其IgM类抗体的效价（Titer），或称滴度。

（2）IgG类抗体效价滴定

①IgM类抗体的破坏：

须取适量血清或血浆（0.5或1.0m1）加等体积2-Me溶液（也可选用DDT试剂）混合，封口，置37℃水浴箱孵育30分钟。

②血清（或血浆）连续倍量稀释：

操作步骤与IgM类ABO血型抗体倍量稀释方法相同。

③效价滴定操作

经典间接抗人球法：

在倍比稀释血清或血浆中加入3％对应的A型（或B型）红细胞悬液50µl，37℃水浴30分钟；生理盐水洗涤3遍，最后1遍在吸水纸上控干，加入抗IgG抗人球蛋白试剂血清1滴，使用血型血清学专用离心机在1000g条件下，离心15秒后观察并记录结果。

凝聚胺法：

在倍比稀释血清或血浆中加入3％对应的A型（或B型）红细胞悬液50µ1混匀；各试管分别加LIM液0.65ml，充分混合均匀后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均匀；使用血型血清学专用离心机Ⅱ档（在1000g条件下，15秒）离心，把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约0.1ml液体；轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做以上步骤；最后加入Resus-pending液2滴，轻轻转动试管混合并同时观察结果。

如果在30秒至1分钟内凝集散开，为阴性；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，需要具体判断凝集强度。

DiaMedCoombs卡式法：

撕掉Coombs卡上的锡箔，在每一个反应孔下做好标记；依次在每孔中加入0.8％的A型（或B型）红细胞悬液50µl和倍比稀释后血清或（血浆）25µ1；37℃孵育15分钟，达亚美专用离心机在1030g条件下，离心10分钟后判断结果。

AutoVuelnnovaCoombs卡式法：

撕掉Coombs卡上的锡箔，在每一个反应孔下做好标记；先向每个反应柱内加入50rtlBILSS液，再分别向反应柱内加入10rd3％A型（或B型）红细胞悬液，最后向反应柱内加入40µl患者血清或血浆；观察柱中的反应物各组分是否混匀，必要时轻弹几下微柱，使反应物充分混匀；37℃孵育10分钟，用BioVue离心机双向离心5分钟，离心必须在加样后30分钟内进行；从微柱正反两面判读并记录结果。

④结果判定：

通常每