临床研究用人间充质干细胞质量评价.docx
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临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价
人间充质干细胞（humanMSCs, hMSCs）是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等等组织。
除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。
过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。
目前在clinicaltrial.gov登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮，等等。
然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。
其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和技术的合理性等问题，因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性，或结果难以重复，因此也很难形成相对统一的质量标准。
而临床研究中所存在的问题是，绝大多数临床研究还处在早期阶段，所观察的病例数还很有限，临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异，所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。
除此以外，因hMSCs临床前研究还远不够完善，对其临床研究的指导作用还不强，或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象，临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立，等等。
所有这些问题均不同程度地反映出研发者或从业者对临床研究用hMSCs质量属性的认识深度和广度，以及对相关质量的控制能力仍存在很大差异。
类似于所有治疗性细胞产品，hMSCs代表着人类医药发展史上最为复杂的医药产品，具有传统医药产品难以比拟的多样性、变异性、复杂性和不稳定性等质量特性。
为有效保障包括hMSCs在内的所有治疗性细胞的质量，为其标准化使用和规范化管理，就需在相应监管属性的规定下，结合hMSCs的科学性和制备工艺相关风险因素等考虑，综合全面地把握相关细胞产品的质量属性。
基于这一思想，hMSCs应具备基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性“四大类”质量属性。
这“四大类”质量属性，应属于“狭义”质量要素，是质量标准、质量体系建立的对象，是临床前研发阶段首要解决的关键问题，也是整个细胞产品研发周期全质量要素的基础。
以往我国由于忽视了对这一内容的完整性研究和相应综合质量体系的建立，因此在一定程度上影响了我国hMSCs临床研究的高质量发展。
为使hMSCs能够持续稳定地满足临床研究的质量要求，首先需建立与其“四大类”质量属性相适应的质量体系。
相关质量体系应包括以GMP原则为基础的质量保障体系，和由综合性质量评价技术和评价规范所构成的质量评价体系。
其中，质量评价技术是指针对hMSCs各质量属性所建立起的、具有共识性的各类物理、化学及生物学评价技术。
质量评价规范是规范在产品研发或生产制备的不同阶段，依据不同的质量控制目标，选择合理的评价技术或技术组合，以及合理的评价策略，对相关产品进行有效的质量评价，其根本目标应是提高产品研发效率和提升产品研发的管理/监管水平。
就质量体系而言，首先需要建立和完善的，是保障不同组织来源hMSCs共性质量属性/质量要求的质量体系，包括与之相关的质量评价体系、评价规范。
hMSCs质量评价规范的设计应是依据相关领域目前在hMSCs科学性方面的共识、不同组织来源hMSCs质量研究成果及质量控制经验，以及现阶段的管理/监管能力和需要，特别是现阶段以《干细胞临床研究管理办法（试行）》（2015）和《细胞制品研究与评价技术指导原则（试行）》（2017）为代表的“类双轨制”管理模式的需要。
本文在对有关hMSCs质量研究成果、质量评价的实践经验总结，和在质量评价规范相关理论探索的基础上，综合上述各方面的考虑，提出了《临床研究用人间充质干细胞质量评价规范（讨论稿）》。
本文内容涵盖了对hMSCs“四大类”质量属性/质量要求的介绍、针对“四大类”质量属性的评价内容、不同类型的质量评价规范，和质量评价规范与现行“类双轨制”管理模式的关联性。
希望与hMSCs治疗研究各有关方就本文内容进行深入讨论，使其最终成为服务于我国hMSCs制剂/制品研发在质量评价规范上的共识，以便更好地指导和支撑我国hMSCs“临床研究”备案申报和/或“临床试验”注册审评工作。
一、hMSCs的质量属性和质量要求
不同组织来源、符合临床研究基本监管属性的hMSCs，应具备“四大类”质量属性，即基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性和生物学有效性。
这“四大类”质量属性也是临床研究用hMSCs的‘四大类’质量要求。
1.
1.1. hMSCs的基本细胞生物学属性
2.
不同组织来源的hMSCs基本细胞生物学属性应包括细胞鉴别、活性、纯度和均一性等。
细胞鉴别的质量属性是由相关细胞的形态学、遗传学、代谢谱学、分子标志物（或标志物群）表达特征，以及独特的生物学功能等属性构成。
细胞活性是由细胞活率、增殖周期、倍增时间、克隆形成率、端粒酶活性（和/或端粒长度）等生物学特征综合体现；细胞纯度和均一性是指在细胞制备过程中所引入的非相关细胞，以及相同来源、相同细胞类型和相同代次或相同级别的细胞（如同一级细胞库的细胞）在生物学特性方面的纯度和均一性。
1.
1.2. hMSCs的微生物学安全性
2.
hMSCs的微生物学安全性，是指相关细胞需满足无细菌、真菌、支原体、病毒污染，以及无微生物代谢产物污染的质量要求。
其中，病毒污染是指来源于供者或是制备工艺所引入的种属特异病毒（如人源病毒和动物源性病毒）、内外源性逆转录病毒，以及所有非特定病毒因子。
微生物代谢产物是以革兰氏阴性菌所产生的内毒素为代表。
为确保hMSCs微生物学安全性，除需建立细胞供者筛选标准、建立基于cGMP原则的质量保障体系外，还需设立基于各种评价规范的过程控制及终产品质量控制，并通过体外细胞模型、敏感动物接种及鸡胚接种等方法，对潜在污染的微生物及其代谢产物进行有效评价。
1.
1.3.hMSCs的生物学安全性
2.
hMSCs的生物学安全性质量属性是指其细胞内在的、由其生物学特性所决定的，和外在的、诱发其生物学特性发生改变相关的安全性问题。
通过对hMSCs生物学安全性评价，希望能预测或排除hMSCs进入体后所产生的成瘤性和/或促瘤性、异常免疫反应、异常分化、异位迁移或异位停留等生物学安全性问题。
在对hMSCs生物学安全性进行评价时，应尽可能考虑相关细胞的临床适应症、给药途径、剂量等与临床治疗直接相关的因素，并利用合适的体内、体外试验模型对相关的生物学安全性进行有效评估。
1.
1.4.hMSCs生物学有效性
2.
hMSCs生物学有效性质量属性，是指与其临床治疗效应密切相关的各种生物学特性或机制的总和，是临床前研究阶段用于预测hMSCs临床治疗效应的重要质量要求。
不同组织来源的hMSCs生物学有效性质量属性，可归类为诱导分化功能、免疫调控能力及组织再生功能。
其中，诱导分化功能主要是指在体外特定诱导分化条件下，相关细胞向目的细胞分化的能力。
目前用于评价hMSCs诱导分化功能的目的细胞分化，包括成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化。
免疫调控功能是指hMSCs释放免疫调控分子、抑制促炎性免疫细胞增殖或活性、促进调节性免疫细胞增殖或极化的功能。
组织再生功能是指不同组织来源的hMSCs所具有的保护组织细胞抗凋亡损伤、促进病损组织血管再生、刺激病损组织内源性干细胞增殖和分化等功能。
对hMSCs生物学有效性进行评价，需结合体外细胞模型和体内动物模型进行综合评价。
在使用动物模型时，应尽可能地在临床适应症、给药途径、剂量等与临床治疗直接相关因素充分考虑的基础上，对相关细胞生物学有效性进行评价。
二、hMSCs的质量评价内容
在对具体hMSCs制剂/制品进行质量评价时，可根据其生物学特性、制备工艺、风险因素、管理目标和管理模式的要求，选择合理的评价内容和评价技术，以特定的质量价规范（见后述）对其进行质量评价。
2.1.hMSCs基本细胞生物学属性的评价内容
2.1.1. 细胞形态 光学显微镜下的细胞形态
2.1.2. 个体遗传多态性或遗传指纹图谱-STR（短串联重复序列， shorttandemrepeats）图谱。
用于评价相关细胞的独立个体来源、纯度和可能与其它人源细胞间的交叉污染。
2.1.3. 细胞表面标志物的检测 包括对hMSCs阳性表面标志物群（如CD73,CD90,CD105,CD44,CD166，其阳性率应不低于95%），和阴性表面标志物群（如CD11b或CD14、CD19或CD79a、CD34、CD45和HLA-DR，其阳性率应不高于2%）进行检测。
2.1.4.种属间细胞污染的检测 可利用同工酶谱分析或种属遗传多态性基因分析-基于细胞色素b基因多态性的核酸扩增分析，对相关细胞的种属特征和种属间不同细胞交叉污染进行评价。
2.1.5.细胞活性 通过对细胞活率、群体倍增时间、克隆形成率、细胞周期等对细胞活性进行综合评价。
2.1.6. 中期染色体核型分析正常染色体核型应为46XX或者46XY，无缺失、重复、倒位、易位等结构异常。
2.2.hMSCs微生物学安全性评价内容
hMSCs微生物学安全性检测应包括对细菌、真菌、支原体、各类病毒等进行相关病原物（如核酸、蛋白、多糖）或微生物代谢物的可直接检测，也可利用细胞模型或动物模型，对相关微生物的存在和效应进行间接分析。
2.2.1.无菌检测-细菌、真菌检测
确证性无菌检测应按照现行版药典所要求的培养法进行检测，还可采用全自动细菌/分枝杆菌检测系统进行无菌检测。
另外，还可进行革兰氏染色法镜检，或针对病原物的核酸或特定代谢物进行快速放行检验。
可依据工艺阶段、管理需要、临床应用需要等，采用不同时间针对不同工艺阶段的细胞，选择不同检测方法。
2.2.2.支原体检测
需依据药典中规定的培养法和指示细胞感染法（或称DNA染色法）相结合进行确证性支原体检测。
也可应用支原体核酸扩增方法作为快速放行方法。
需根据不同的评价规范，针对不同工艺阶段的细胞采取确证方法和放行方法相结合的支原体检测。
2.2.3.特定病毒和非特定病毒检测
人源特定病毒包括HIV-1/2、HTLV、HBV、HCV、CMV、EBV、人细小病毒B19、多种亚型的人乳头瘤病毒（HPV）、人疱疹病毒（HHV）等。
相关检测以病原体核酸检测为主，使用国家批准的体外诊断试剂盒进行检测。
牛源病毒的检测，包括牛副流感病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛腹泻病毒和弧肠孤病毒等。
猪源病毒的检测，包括猪细小病毒、猪细环病毒以及猪圆环病毒等。
逆转录病毒检测，可依次包括逆转录酶活性检测（PERT或PBRT法）、透射电镜观察可能存在的病毒颗粒，以及利用特定敏感细胞对病毒感染力进行检测。
非特定病毒（或非特定致病因子）检测，包括直接细胞培养法观察其对异体动物的血吸附性和血凝集效应，通过易感细胞体外接种方法（如三种细胞传达接种法）对可能的细胞病变效应、血吸附和凝集效应进行评价，和选择易感动物接种对可能的组织病变效应进行广谱性筛查。
2.2.4.细菌内毒素检测应使用现行版药典所建议的凝胶法和光度测定法，以及改
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