常见分子操作基本步骤打印.docx
《常见分子操作基本步骤打印.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常见分子操作基本步骤打印.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
常见分子操作基本步骤打印
常见分子操作基本步骤
1、总RNA的提取（BIOZOL法提取）1
2、植物种胚中RNA的提取（CTAB-LiCl提取法）3
3、两步法RT-PCR4
4、琼脂糖核酸电泳7
5、胶回收纯化DNA（AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒）9
6、连接（T载体连接）11
7、连接（T4酶连）12
8、感受态细胞的制备（大肠杆菌）13
9、质粒DNA的提取（碱裂解法）15
10、酶切16
11、Ni柱纯化His-tag蛋白质17
11.1非变性条件下抽提His-Tag蛋白质17
11.2变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质21
12、NTA树脂的再生23
1、总RNA的提取（BIOZOL法提取）
从植物组织分离RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。
RNA分离的最关键因素是尽量减少RNase的污染。
但RNase活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性Rnase外，环境中也存在大量Rnase。
外源性的Rnase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的Rnase也会造成污染。
这些外源性的Rnase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的Rnase。
因此在提取RNA时，应尽量创造一个无Rnase的环境，包括去除外源性Rnase污染和抑制内源性Rnase活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性Rnase，通过Rnase的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性Rnase（注：
BIOZOL溶液包含异硫氰酸胍和苯酚，实验时请格外小心）。
在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80°C冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
步骤：
（1）提取植物组织RNA前，应先将研磨用的器具洗净；研磨前用液氮将所有器具及待用的灭菌EP管预冷，避免样品潮解；
（2）用液氮将上述组织研磨后迅速转入预冷的EP管中，每50～100mg组织用1mlBIOZOL试剂对组织进行裂解，立即混匀，在室温15~30°C下放置5分钟；
（3）在上述EP管中，按照每1mlBIOZOL加0.2ml氯仿的量（1/5体积）加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15°C～30°C）放置2～3分钟后，12000g（2°C～8°C）离心15分钟；
（4）取上层水相置于新EP管中，加入等体积异丙醇（每1mlBIOZOL约加0.6ml异丙醇），-20°C放置10~30分钟，12000g（2°C～8°C）离心10分钟；
（5）弃上清，加1ml75%乙醇进行洗涤，轻轻混合，7500g（2°C～8°C）离心5分钟，弃上清；
（6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；
（7）用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。
2、植物种胚中RNA的提取（CTAB-LiCl提取法）
植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，而某些植物组织中富含多糖、脂质及酚类物质，往往不利于RNA的分离和纯化，因此能否有效地去除多糖和脂质是提取高质量植物RNA成败的关键。
CTAB-LiCl提取法可在不用液氮的室温下有效地排除剥取种胚中大量带有的多糖和本身脂质的干扰，并进一步满足RT-PCR等实验的需要，适用于富含多糖和脂质的植物组织RNA提取。
步骤：
（1）在1.5mlEP管中加入700μL的RNA提取液（2%CTAB（w/v），内含2%～5%PVP（w/v），100mmol/LTris-HCl（pH8.0），25mmol/LEDTA（pH8.0）和2.0mol/LNaCl，灭菌，使用前加入β-巯基乙醇使其终浓度为2%～5%（v/v）），并置于65°C水浴锅中温育0.5h以上；
（2）将灭菌镊子剥取的水稻种胚直接加入RNA提取液，灭菌玻璃棒捣碎，涡旋混合，继续在65°C温育10min；
（3）加入等体积的氯仿+异戊醇，涡旋混匀后4°C10000g离心10min，用灭菌枪头小心剔除漂浮的脂肪层，吸取上清；
（4）重复上述步骤，并在合并的上清中加入1/4体积的10mol/LLiCl溶液并混匀，4°C条件下过夜，使RNA沉淀；
（5）次日，于4°C，10000rpm离心20min，弃上清；
（6）用Rnase-freewater溶解RNA；
（7）再加入0.1体积3mol/L的NaAc和2.5体积95%乙醇，置于-20°C环境下30min使RNA沉淀；
（8）4°C，10000rpm再次离心20min，弃上清，最后用70%的乙醇清洗沉淀，吹干后用Rnase-freewater溶解RNA沉淀，保存于-20°C冰箱中备用。
3、两步法RT-PCR
步骤：
第一步：
逆转录反应（TaKaRaAMV酶法）
（1）将以下实验材料混匀后，离心，65°C5min，立即冰水浴，稍离心，以去除二级结构。
Reagent（反应物）
Quantity,for20µl
ofreactionmixture
Oligo（dT）
1µl
10mMdNTPmix
2µl
RNaseFreedH2O
5µl
实验样品RNA（1~2µg）
2µl
Total
10µl/Sample
（2）将以下材料混匀，离心，42°C2h，最后95°C10min（使AMV变性），混匀离心后-20°C保存。
Reagent
Quantity,for20µl
ofreactionmixture
5×AMVbuffer
4µl
AMV
0.5µl
RNaseFreedH2O
5.5µl
Total
20µl/Sample
第二步：
PCR反应
（1）按下列组成在PCR反应管中调制反应液
Reagent
Quantity,for20µl
ofreactionmixture
灭菌水
14.6µl
10×TaqBuffer
2µl
25mMMgCl2
1.2µl
10mMdNTPmix
0.4µl
上游引物10pmol/μl
0.3µl
下游引物10pmol/μl
0.3µl
Taq酶
0.2µl
cDNA模板
1µl
Total
20µl/Sample
（2）按以下条件进行反应
Step
Temperature,°C
Time,min
Numberofcycles
Note
预变性
94
5
1
变性
94
0.5
25-35
退火
37-65
0.5
退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化
延伸
72
根据扩增产物的大小
Taq酶每分钟延伸1000bp
最终延伸
72
10
1
4、琼脂糖核酸电泳
（1）用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，擦干后放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；
（2）根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：
准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（TBE）；
（3）放入到微波炉内加热熔化。
轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，冷却片刻（以不烫手为宜），倒入电泳槽中，待其凝固；
（4）室温下30分钟左右凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；
（5）向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；
（6）在DNA样品中加入6×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；
（7）接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。
一般60～100V电压，电泳20～40min即可；
（8）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；
（9）电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5%
1,000～30,000
0.7%
800～12,000
1.0%
500～10,000
1.2%
400～7,000
1.5%
200～3,000
2.0%
50～2,000
5、胶回收纯化DNA（AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒）
一、实验准备
（1）、第一次使用前，BufferW2concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
（2）、准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
（3）、准备75°C水浴。
（4）、使用前，检查BufferDE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70°C温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。
二、操作步骤
（1）、在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。
计算凝胶重量（提前记录离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl体积）。
（2）、加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75°C加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min）。
*BufferDE-A为红色溶液。
在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
（3）、加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。
*加BufferDE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
（4）、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g离心1min。
弃滤液。
（5）、将制备管置回2ml离心管，加500μlBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液。
（6）、将制备管置回2ml离心管，加700μlBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。
以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次12,000×g离心1min。
*确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
*两次使用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。
（7）、将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。
（8）、将制备管置于洁净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备膜中央小心加入25-30μlEluent或去离子水，室温静置1min；12,000×g离心1min洗脱DNA。
*将Eluent或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。
三、注意事项
（1）、在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。
勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。
（2）、在步骤2中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA回收率。
（3）、将Eluent
升级会员 