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1、常见分子操作基本步骤打印常见分子操作基本步骤1、总RNA的提取（BIOZOL法提取） 12、植物种胚中RNA的提取（CTAB - LiCl 提取法） 33、两步法RT-PCR 44、琼脂糖核酸电泳 75、胶回收纯化DNA （AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒） 96、连接（T载体连接） 117、连接（T4 酶连） 128、感受态细胞的制备（大肠杆菌） 139、质粒DNA的提取（碱裂解法） 1510、酶切 1611、Ni柱纯化His-tag蛋白质 1711.1 非变性条件下抽提His-Tag蛋白质 1711.2 变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质 2112、NTA树脂的再生 23

2、 1、总RNA的提取（BIOZOL法提取）从植物组织分离RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNase的污染。但RNase活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性Rnase外，环境中也存在大量Rnase。外源性的Rnase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的Rnase也会造成污染。这些外源性的Rnase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的Rnase。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无Rnase的环境，包括去除外源性Rnase污染和抑制内源性Rnase

3、活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性Rnase，通过Rnase的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性Rnase（注：BIOZOL溶液包含异硫氰酸胍和苯酚，实验时请格外小心）。在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80 C冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。步骤：（1）提取植物组织RNA前，应先将研磨用的器具洗净；研磨前用液氮将所有器具及待用的灭菌EP管预冷，避免样品潮解；（2）用液氮将上述组织研磨后迅

4、速转入预冷的EP管中，每50100 mg组织用1 ml BIOZOL试剂对组织进行裂解，立即混匀，在室温1530 C下放置5分钟； （3）在上述EP管中，按照每1 ml BIOZOL加0.2 ml氯仿的量（1/5 体积）加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15 C30 C）放置23分钟后，12000g（2 C8 C）离心15分钟；（4）取上层水相置于新EP管中，加入等体积异丙醇（每1 ml BIOZOL约加0.6 ml异丙醇），-20 C放置1030分钟，12000g（2 C8 C）离心10分钟；（5）弃上清，加1 ml 75 %乙醇进行洗涤，轻轻混合，7500g（2 C

5、8 C）离心5分钟，弃上清；（6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；（7）用Rnase-free water溶解RNA沉淀。2、植物种胚中RNA的提取（CTAB - LiCl 提取法）植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，而某些植物组织中富含多糖、脂质及酚类物质，往往不利于RNA的分离和纯化，因此能否有效地去除多糖和脂质是提取高质量植物RNA成败的关键。CTAB-LiCl 提取法可在不用液氮的室温下有效地排除剥取种胚中大量带有的多糖和本身脂质的干扰，并进一步满足RT-PCR等实验的需要，适用于富含多糖和脂质的植物组织RNA提取。步骤：（1）在1. 5 ml EP管中加入700

6、L的RNA提取液（2 % CTAB (w/v)，内含2 %5 % PVP (w/v)，100 mmol/L Tris - HCl（pH8 . 0），25 mmol/L EDTA（pH8 . 0）和2.0 mol/L NaCl，灭菌，使用前加入-巯基乙醇使其终浓度为2 %5 % (v/v) ），并置于65 C水浴锅中温育0.5 h以上；（2）将灭菌镊子剥取的水稻种胚直接加入RNA提取液，灭菌玻璃棒捣碎，涡旋混合，继续在65 C温育10 min ；（3）加入等体积的氯仿+异戊醇，涡旋混匀后4 C 10000g离心10 min，用灭菌枪头小心剔除漂浮的脂肪层，吸取上清；（4）重复上述步骤，并在合并的

7、上清中加入1/4体积的10 mol/L LiCl 溶液并混匀，4 C条件下过夜，使RNA沉淀；（5）次日，于4 C，10000 rpm 离心20 min，弃上清；（6）用Rnase-free water溶解RNA；（7）再加入0.1体积3 mol/L的NaAc和2.5体积95 %乙醇，置于- 20 C环境下30min 使RNA沉淀；（8）4 C，10000 rpm再次离心20 min，弃上清，最后用70 %的乙醇清洗沉淀，吹干后用Rnase-free water溶解RNA沉淀，保存于- 20 C冰箱中备用。3、两步法RT-PCR步骤：第一步：逆转录反应（TaKaRa AMV酶法）（1）将以下实

8、验材料混匀后，离心，65 C 5 min，立即冰水浴，稍离心，以去除二级结构。Reagent（反应物）Quantity, for 20lof reaction mixtureOligo (dT)1 l10 mM dNTP mix2 lRNase Free dH2O5 l实验样品RNA（12 g）2 lTotal10 l /Sample（2）将以下材料混匀，离心，42 C 2 h，最后95 C 10min（使AMV变性），混匀离心后-20 C保存。ReagentQuantity, for 20lof reaction mixture5 AMV buffer4 lAMV0.5 lRNase Fre

9、e dH2O5.5 lTotal20 l /Sample第二步：PCR反应（1）按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity, for 20lof reaction mixture灭菌水14.6 l10 Taq Buffer 2 l25 mM MgCl2 1.2 l10 mM dNTP mix0.4 l上游引物 10 pmol/l0.3 l下游引物 10 pmol/l0.3 lTaq 酶0.2 lcDNA模板1 lTotal20 l /Sample（2）按以下条件进行反应StepTemperature, CTime, minNumber of cyclesNote预变性9

10、451变性940.525-35退火37-650.5退火温度比理论退火温度大概低5 C，再根据反应结果优化延伸72根据扩增产物的大小Taq酶每分钟延伸1000 bp最终延伸721014、琼脂糖核酸电泳（1）用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，擦干后放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；（2） 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（TBE）；（3）放入到微波炉内加热熔化。轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，冷却片刻（以不烫手为宜），倒入电泳槽中，待其凝固；（4）室温下30分钟左右凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放

11、在电泳槽内；（5） 向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；（6） 在DNA样品中加入6 体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；（7） 接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60100V电压，电泳2040min即可；（8） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；（9） 电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度

12、线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5 %1,00030,0000.7 %80012,0001.0 %50010,0001.2 %4007,0001.5 %2003,0002.0 %502,0005、胶回收纯化DNA （AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒）一、实验准备（1）、第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。（2）、准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。（3）、准备75 C水浴。（4）、使用前，检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70 C温浴加热溶解并冷却至室温后再使用。二、操作步骤(1)、在紫外灯下切下含有目的DNA

13、 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 l体积）。(2)、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75 C加热（低熔点琼脂糖凝胶于40 C加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约6-8 min）。* Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。(3)、加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA 片段小于400 bp 时，加入1个凝胶体积的异丙醇。* 加Buffer DE-B 后混合物颜色

14、变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。(4)、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000g离心1 min。弃滤液。(5)、将制备管置回2 ml 离心管，加500 l Buffer W1，12,000g 离心30 s，弃滤液。(6)、将制备管置回2 ml 离心管，加700 l Buffer W2，12,000g 离心30 s，弃滤液。以同样的方法再用700 l Buffer W2 洗涤一次12,000g 离心1 min。* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。* 两次使用Buffer W

15、2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。(7)、将制备管置回2 ml 离心管中，12,000g 离心1 min。(8)、将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央小心加入25-30 l Eluent 或去离子水，室温静置1 min；12,000g 离心1 min 洗脱DNA。* 将Eluent 或去离子水加热至65将提高洗脱效率。三、注意事项(1)、在步骤1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。(2)、在步骤2 中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA 回收率。(3)、将Eluent