分析与检测实验教程Word文件下载.docx

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第十一周

7

高效液相色谱仪的使用

第十二周

8

气相色谱仪的使用

气质联用仪实验室

第十三周

9

气质联用仪的使用

高效液相色谱仪实验室

第十四周

分组：

全班48人，两大组，每大组24人，每大组6小组，每小组4人

实验一发酵原料中粗蛋白质的测定（微量凯氏定氮法）

食品中蛋白质的测定GB5009.5-2010

一、实验目的

1、掌握微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理。

2、熟练掌握微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的操作技术。

二、实验原理

凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。

当含氮有机样品与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

此过程通常称为“消化”。

但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。

CH2NHRCOOH 

+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3

2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4

消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，

（NH4）2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑

借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，

2NH3+4H3BO3→（NH4）2B4O7+5H2O

然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。

根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。

（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

多少植物原料中蛋白质的含氮量约为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。

三、仪器与试剂

1、仪器

①共用：

：

电子天平（感应量1mg）1台，称量纸若干、蒸馏水

②每组：

250mL定氮瓶1个、100mL容量瓶2个、小漏斗1个、石棉网1个、电炉1个、铁架台2套、胶头滴管2支、10mL移液管1支、微量酸式滴定管1支、20mL移液管1支、玻璃珠数粒、定氮蒸馏装置1套、100mL烧杯1个、100mL三角瓶2个、2mL移液管2支

2、试剂

（1）硫酸铜（CuSO4·

5H2O）、硫酸钾（K2SO4）、硫酸（H2SO4密度为1.84g/L）、硼酸（H3BO3）、甲基红指示剂（C15H15N3O2）、溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）、氢氧化钠（NaOH）、95%乙醇（C2H5OH）、蒸馏水。

（2）硼酸溶液（20g/L）：

称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000mL。

（3）氢氧化钠溶液（400g/L）：

称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

（4）盐酸标准滴定溶液（0.0500mol/L）。

（5）甲基红乙醇溶液（1g/L）：

称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（6）溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：

称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100mL。

（7）混合指示液：

1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

（8）酿酒原料：

干燥、粉碎、过筛（60－80目）

四、实验步骤

1、试样处理：

称取充分混匀的固体试样2.000g（约相当于30～40g氮），移入干燥的250mL定氮瓶中，加入0.2g无水硫酸铜、6g硫酸钾及20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°

角斜支于石棉网上，用电炉小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5h。

取下放冷，小心加入20mL水。

放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

同时做试剂空白试验。

（已制备）

2、装置的清洗：

按下图1装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加1g/L甲基红乙醇溶液2～3滴及2mL浓硫酸，以保持水呈酸性，打开螺旋夹7及漏斗4下的夹子，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾，使水蒸汽通入装置的各个部分，以达到清洗的目的。

在冷凝管下端放置一个三角瓶接收冷凝水，然后关紧螺旋夹7及漏斗4下的夹子，继续用蒸汽洗涤5min。

冲洗完毕，夹紧蒸汽发生器与收集器之间的连接橡胶管3，反应室5中的废液由于减压而倒吸进入反应室外层6，打开反应室外层6下端的螺旋夹排除废液。

如此清洗2－3次。

图1定氮蒸馏装置

1－电炉；

2－水蒸气发生器（2L烧瓶）；

3－螺旋夹；

4－小玻杯及棒状玻塞；

5－反应室；

6－反应室外层；

7－橡皮管及螺旋夹；

8－冷凝管；

9－蒸馏液接收瓶。

3、装置清洗程度的检查：

向接收瓶内加入20.0mL20g/L硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下0.5cm处，蒸馏l～2min，观察接收瓶内的溶液是否变色。

如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。

移去三角瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝管下口，关闭电炉，仪器即可供测定样品使用。

4、样品蒸馏：

向接收瓶内加入20.0mL20g/L硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下。

注意在加样前务必打开反应室外层活塞7，以免三角瓶内液体倒吸。

准确吸取2.0mL（V3）试样处理液由小玻杯4注入反应室5，以约10mL蒸馏水水洗涤小玻杯并使之流入反应室内。

然后，将10.0mL400g/L氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加约5mL蒸馏水于小玻杯以防漏气。

夹紧螺旋夹7，开始蒸馏。

蒸馏10min（接收瓶液体由酒红色变成绿色），然后移动蒸馏液接收瓶，使液面离开冷凝管下端约1cm，再蒸馏1min。

然后用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。

5、滴定：

选用微量酸式滴定管，以0.0500mol/L盐酸标准滴定溶液滴定，直至接收瓶混合液体由绿色变为酒红色为滴定终点，记录消耗盐酸的体积（V1）。

同时作试剂空白，记录其消耗盐酸的体积（V2）。

五、结果计算

试样中蛋白质的含量按如下公式计算：

式中X－试样中蛋白质的含量，g/100g；

V1－试液消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；

V2－试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；

V3－吸取消化液的体积，mL；

C－盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；

0.0140－1.0mL盐酸[c（HCl）=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m－试样的质量，g；

F－氮换算为蛋白质的系数。

一般谷物为6.25；

纯乳或；

大米5.95；

大麦、小米、燕麦、裸麦5.83；

面粉5.70；

玉米、高粱6.24；

花生5.46。

六、结果与要求

1、计算蛋白质含量，并作适当分析。

2、蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；

蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

六、注意事项

1．在蒸馏过程中，切勿关闭电炉，否则会引起硼酸液的倒吸。

2．环境中氨气的含量要低。

3．定氮仪各连接处绝对不能漏气。

4．所用橡皮塞、管用前均需处理。

其方法是：

浸在10％氢氧化钠溶液中煮沸约10min，再经水洗和水煮10min，最后冲洗数次。

七、思考题

1、本实验操作过程应注意哪些问题

2、试述常量、半微量、微量凯氏定氮法的仪器装置的区别。

实验二粮食中粗淀粉的测定（酸水解法）

食品中淀粉的测定GB/T5009.9-2008

1、掌握酸水解法测定粗淀粉含量的原理。

2、熟练掌握费林试剂法测定还原糖含量的操作技术。

试样经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用酸水解成具有还原性的单糖，然后按还原糖测定，并折算成淀粉。

水浴锅、回流装置、250mL锥形瓶等

（1）氢氧化钠（NaOH）、乙酸铅PbC4H6O2）、硫酸钠（Na2SO4）

（2）甲基红指示剂（2g/L）：

称取甲基红0.20g，用少量乙醇溶解后，定容至100mL；

称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，稀释至100mL；

（4）乙酸铅溶液（200g/L）：

称取20g乙酸铅，加水溶解，稀释至100mL；

（5）硫酸钠溶液（100g/L）：

称取10g硫酸钠，加水溶解，稀释至100mL；

（6）盐酸溶液（1：

1，v/v）：

量取50mL浓盐酸，加50mL水混合

（7）精密pH试纸：

6.8～7.2

将试样（大米）磨碎过40目筛，称取2.000g大米粉置于250mL锥形瓶中，加入30mL盐酸溶液（1：

1，v/v），轻轻振摇使试样充分润湿，接好冷凝管，置沸水浴中回流1h，立即取出冷却。

加入2滴甲基红指示液，以400g/L氢氧化钠调至黄色，再以盐酸溶液（1：

1，v/v）校正至水解液刚变红色。

若水解液颜色较深，可用精密试纸测试调至pH7。

然后加20mL200g/L乙酸铅溶液，摇匀，放置10min。

再加20mL100g/L硫酸钠除去过多的铅。

摇匀后滤纸过滤，滤液转入500mL容量瓶，用水洗涤残渣和锥形瓶，洗液合并于容量瓶中，加水稀释至刻度。

摇匀即得水解糖液。

2、碱性酒石酸铜溶液的标定：

吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL碱性酒石酸铜乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加约9mL1g/L葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸，微沸下以每秒一滴的速度继续滴加1g/L葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，后滴定操作需在1min内完成，消耗糖液在1mL内。

记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，计算每10mL（甲液、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。

m’－10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg；

ρ－葡萄糖标准溶液的浓度，g/L;

V－标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

3、试样溶液预测：

吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL碱性酒石酸铜乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠两粒，控制在2min内加热至沸，微沸下以先快后慢的速度，从滴定管中滴加试样溶液，待溶液颜色变浅时，以每两秒一滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

记录试样溶液消耗体积。

当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再测定，使每次滴定消耗样液体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的葡萄糖标准溶液的体积相近，约10mL。

4、试样溶液测定：

吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL碱性酒石酸铜乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠两粒，从滴定管滴加比预测体积少1mL的试样溶液至锥形瓶中，控制在2min内加热至沸，微沸下以每两秒一滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。

同时量取50mL水及与试样处理时相同量的盐酸溶液，按同一方法做试剂空白试验。

试样中淀粉的含量按以下公式计算：

X－试样中淀粉含量，g/100g;

A1－测定用试样中水解液还原糖质量，mg；

A2－试剂空白中还原糖的质量，mg；

0.9－还原糖（以葡萄糖计）折算成淀粉的换算系数；

m－试样质量，g；

V－测定用试样水解液体积，mL；

500－试样液总体积，mL。

1、计算样品中淀粉的含量，并适当分析试验结果。

2、计算结果保留到小数点后一位。

1、斐林试剂甲、乙液分别贮存，用时混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会发生分解；

2、样品中含糖量高时需适当加大样品溶液的稀释；

3、滴定终点判断时，需用白色做背景，便于观察溶液从蓝色转变为无色，且必须在沸腾时观察，否则易氧化成蓝色不易判别终点；

4、样品中含较多可溶性糖时，可先用乙醇溶解除去可溶性糖再测定淀粉含量。

1、

实验三酱油中氨态氮的测定（甲醛值电位滴定法）

酱油卫生标准的分析方法GB/T5009.39-2003

1、掌握甲醛值电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮含量的原理。

2、熟练掌握甲醛值电位滴定法测定酱油中氨基酸态氮含量的操作技术。

利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点，适用于深色样品溶液的测定。

（1）酸度计，附磁力搅拌器和搅拌子

（2）10mL碱式滴定管，5mL、10mL移液管，100mL容量瓶，250mL、100mL烧杯，洗瓶，100mL量筒，胶头滴管

甲醛溶液：

36%，应不含聚合物

氢氧化钠标准滴定溶液[c（NaOH）=0.050mol/L]：

pH6.86标准磷酸缓冲溶液、pH9.18标准磷酸缓冲溶液

酱油：

滤纸条

1、pH计开机前准备与预热

取下复合电极套，用蒸馏水清洗电极，用滤纸条吸干。

打开电源开关预热30min。

2、pH计的标定（2点标定）

（1）在测量电极插座处插入复合电极，将选择开关旋钮调到pH档

（2）调节温度补偿旋钮白线对准溶液温度值；

（1）拔下电路插头，在测量电极插座处插入复合电极；

（2）把选择开关旋钮调到pH档；

（3）测量试液温度，调节温度补偿旋钮白线对准溶液温度值；

（4）斜率调节旋钮顺时针旋到底；

（5）把清洗过的电极插入pH=6.86的标准缓冲液中；

（6）调节定位调节旋钮，使仪器读数与该缓冲溶液当时温度下的pH值相一致；

（7）用蒸馏水清洗电极，用滤纸条吸干，再插入pH=9.18的标准缓冲液中；

（8）调节斜率调节旋钮，使仪器读数与该缓冲溶液当时温度下的pH值相一致。

（9）用蒸馏水清洗电极，用滤纸吸干。

3、样品测定

吸取5.0mL酱油，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液［c（NaOH）=0.05mol/L］滴定至酸度计指示pH=8.2（记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数，可计算总酸含量〕。

加入10.0mL甲醛溶液，混匀。

再用氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）继续滴定至pH=9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）的毫升数。

同时取80mL蒸馏水，先用氢氧化钠溶液（0.05mol/L）调节pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）滴定至pH=9.2，同时做试剂空白试验。

4、测量结束关机

用蒸馏水清洗电极，用滤纸吸干；

套上复合电极套，套内应放少量3mol/L氯化钾溶液补充液；

拔下复合电极，接上短接线，以防止灰尘进入，影响测量准确性；

关机。

样品中氨基酸态氮的含量按下式计算：

式中：

X—试样中氨基酸态氮的含量（以氮计）,g/100mL;

V1—测试用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定液的体积，mL;

V2—试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定液的体积，mL;

V3—试样稀释液取用量，mL;

c—氢氧化钠标准滴定溶液浓度，mol/L;

0.014—与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液［c（NaOH）=1.000mol/L〕相当的氮的质量，g。

1、计算样品中氨基酸态氮的含量，并适当分析试验结果。

2、计算结果保留两位有效数字。

1、观察敏感膜玻璃是否有刻痕和裂缝；

参比溶液是否浑浊或发霉（有絮状物）；

参比电极的液接界部位是否堵塞；

电极的引出线及插头是否完好，要保持电极插头的清洁；

2、玻璃球泡易破损，使用时要小心,切忌与硬物相接触；

3、电极不得测试非水溶液，如油脂、有机溶剂、牛奶及胶体等等，若不得以测试必须马上清洗，用稀NaHCO3溶液浸泡清洗，时间不得太长，然后用蒸馏水漂洗干净；

4、电极正常测试水温为0~60℃，超过60℃极易损坏电极；

5、电极不得测试含F-高的水样；

6、每次测试结束，电极都须用蒸馏水冲洗干净，特别是测量过酸过碱溶液；

7、电极保护套内的KCl溶液（3mol·

L-1）要及时补充不能干涸。

8、以滤纸或面纸吸干沾湿,不要用纸巾擦拭球泡，可使用被测溶液冲洗电极；

9、待测溶液的最低液位应该高于甘汞电极处

10、缓冲溶液用于校正后就应该倒掉，千万不能把使用过的缓冲液倒回溶液瓶里。

11、如遇到下列情况之一，pH检测仪器则需要重新标定：

⑴溶液温度与定标温度有较大的差异时；

⑵电极在空气中暴露过久，如半小时以上时；

⑶定位或斜率调节器被误动；

⑷测量过酸（pH＜2）或过碱（pH＞12）的溶液后；

⑸换过电极后；

⑹当所测溶液的pH值不在两点定标时所选溶液的中间，且距pH7又较远时。

1、样品中如含有铵盐，是否会影响氨基酸态氮的测定，其结果偏高还是偏低？

2、甲醛的用量越多，酱油中氨态氮含量的测定结果会有什么变化，为什么？

附表：

温度（℃）┄┄PH7┄┄PH4┄┄PH9.2

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

10┄┄┄┄┄┄6.92┄┄4.00┄┄9.33

15┄┄┄┄┄┄6.90┄┄4.00┄┄9.28

20┄┄┄┄┄┄6.88┄┄4.00┄┄9.23

25┄┄┄┄┄┄6.86┄┄4.00┄┄9.18

30┄┄┄┄┄┄6.85┄┄4.01┄┄9.14

40┄┄┄┄┄┄6.84┄┄4.03┄┄9.01

50┄┄┄┄┄┄6.83┄┄4.06┄┄9.02

实验四紫外可见分光光度计的使用（双波长法）

1、掌握紫外可见分光光度计的使用方法。

2、了解紫外可见分光光度计的结构原理。

3．熟悉双波长法测定稻米直链淀粉和直链淀粉的含量测定方法。

根据朗伯—比尔定律，用紫外--可见分光光度法很容易定量测定在此光谱区内有吸收的单一成分。

由两种组分组成的混合物中，若彼此都不影响另一种物质的光吸收性质，可根据相互间光谱重叠的程度，采用相对应的方法来进行定量测定。

有如下三种情况（a、b为两组分简称）：

①两组分光谱不重叠，a，b不互相干扰，分别选择各自适当波长λ1、λ2按测定单一组分的方法测定

②两组分光谱部分重叠，a的测定不；

受干扰，而b的测定受到干扰，a按单一组分测定方法在λ1测定，b在λ2处测定，减去a的含量；

③两组分吸收峰大部分重叠时，a、b互相干扰，可采用双波长法联立方程组进行测定。

根据双波长比色原理，如果溶液中某溶质在两个波长下均有吸收，则两个波长的吸收差值与溶质浓度成正比。

直链淀粉与碘作用产生纯蓝色，支链淀粉与碘作用生成紫红色。

如果用两种淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描（400-1000nm）或做吸收曲线，可以得到如图所示结果。

电子分析天平，T6新世纪紫外-可见分光光度计，pH计，1mL、5mL移液管，滴管，50mL容量瓶9个，500mL烧杯、洗耳球、电炉

碘试剂：

称取碘化钾2.0g,溶于少量蒸馏水，再加碘0.2g,待溶解后用蒸馏水稀释定容至l00mL。

1mol/LKOH：

0.1mol/L盐酸：

无水乙醇：

蒸馏水：

稻米：

直链淀粉储备溶液：

称取0.1000g直链淀粉纯品，放在100mL容量瓶中，加少量无水乙醇湿润，加入1mol/LKOH10mL，在75℃热水浴中溶解后，取出加蒸馏水定容至100mL，混匀，即为1mg/mL直链淀粉储备溶液。

支链淀粉储备溶液：

按上述方法制备1mg/mL支链淀粉储备溶液。

1、测定波长与参比波长的选择

选择26mg/L的直链淀粉和100mg/L的支链淀粉标准溶液分别在紫外-可见光分光光度计上进行400~1000nm波段光谱扫描，得光谱图（见图1），用作图法得直链淀粉测定波长为λ1（633nm），参比波长为λ2（493nm），支链淀粉测定波长为λ3（557nm），参比波长为λ4（744nm）。

2、标准曲线的绘制

（1）双波长直链淀粉标准曲线绘制

分别取直链淀粉储备溶液0、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL放入50mL容量瓶中，加入30mL蒸馏水，以0.1mol/L盐酸调至溶液pH3.5，加0.5mL碘试剂，并用蒸馏水定容至刻度，混匀，得浓度为0、6、10、14、18、22、26mg/L的标准溶液系列，静置15min,以蒸馏水为空白，将所配制的直链淀粉标准溶液系列在λ1和λ2两波长下分别测定吸光度Aλ1、Aλ2，即得：

△A值=Aλ1-Aλ2。

以△A值为横坐标，直链淀粉浓度为纵坐标，得双波长直链淀粉标准曲线。

（2）双波长支链淀粉标准曲线绘制

分别取支链淀粉储备溶液0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL，放入50mL容量瓶中，加入30mL蒸馏水，以0.1mol/L盐酸调至溶液pH3.5，加0.5mL碘试剂，并用蒸馏水定容至刻度，混匀，得浓度为0、40、60、70、80、90、100mg/L的支链淀粉标准溶液系列，静置15min,以蒸馏水为空白，将所配制的支链淀粉标准溶液系列在λ3和λ4两波长下分别测定其嘛吸光度Aλ3、Aλ4，即得：

△A值=Aλ3-Aλ4。

以△A值为横坐标，支链淀粉浓度为纵坐标，绘制双波长支链淀粉标准曲线。

将稻米粉碎过60目筛，称取样品粉末0.100g左右，置于50mL容量瓶，加少量无水乙醇湿润，加1mol/LKOH10mL，在沸水浴中振荡10min取出，然后以蒸馏水定容至50mL后，静置10min。

吸取样品液2.5mL2份（即样品测定液和样品空白液），均加入30mL蒸馏水，以0.1mol/LHCl调pH至3.5左右，在样品测定液中加碘试剂0.5mL，空白液不加碘试剂，然后均定容至50mL，静置