第16章 头孢菌素生产工艺.docx

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第16章头孢菌素生产工艺

第16章头孢菌类抗生素生产工艺

学习目标

了解头孢菌素类抗生素的研发历史和发展趋势

理解头孢菌素及其中间体的结构特点及合成工艺原理

掌握其重要产品的工艺路线选择、工艺原理、过程控制与分析。

抗生素是临床上广泛使用的一类抗菌药，半合成抗生素（Semisyntheticantibiotics）是在天然抗生素的基础上发展起来的，主要针对天然抗生素的低稳定性、毒副作用大、抗菌谱窄等问题，通过化学结构改造，提高稳定性、降低毒副作用、扩大抗菌谱、减少耐药性、改善生物利用度，从而提高药物治疗的效果。

目前已有31个抗生素品种列入《国家基本药物目录（基层医疗卫生机构配备使用部分）》（2015版）中，头孢类产品最多，如头孢氨苄（cefalexin）、头孢他啶（ceftazidime）、头孢唑林（cefazolin）、头孢拉定（cefradine）、头孢呋辛（cefuroxime）、头孢曲松（ceftriaxone）、头孢他啶（ceftazidime）、头孢噻肟（cefotaxime）。

本章分析头孢菌素的半合成生产工艺原理、过程控制及三废处理方法。

16.1概述

头孢菌素（cephalosporin）是含有β-内酰胺环并氢化噻嗪环的抗生素，β-内酰胺环是头孢菌素发挥生物活性的必需基团，在和细菌作用时，β-内酰胺环与细菌发生酰化作用，抑制细菌的生长。

由于β-内酰胺环的张力较大，使其化学性质不稳定易发生开环导致失活，由此开启了对头孢菌素的构效关系研究，以增强其稳定性和广谱抗菌活性。

目前，头孢菌素类抗生素已从第一代发展到第五代。

16.1.1头孢菌素研究

（1）头孢菌素的构效关系头孢菌素是顶头孢菌发酵产物，含有β-内酰胺环并氢化噻嗪环的抗生素，其母核结构如图16-1所示。

图16-1头孢菌素类的母核基本结构

与青霉素相比，头孢菌素稳定性好，对人体的毒性低、抗菌活性强、构效关系明确、抗菌谱广、过敏反应发生率低，药物间彼此不引起交叉过敏反应。

主要原因是β-内酰胺环开裂后不能形成稳定的头孢噻嗪环，而是生成以侧链（R）为主的各异的抗原簇；由于没有共同的抗原簇，各个头孢菌素之间，或头孢菌素与青霉素之间只要侧链（R）不同，就不能发生交叉过敏反应。

由于β-内酰胺环的张力较大，使其化学性质不稳定易发生开环导致失活。

为了提高头孢菌素的对稳定性和抗菌活性，药物化学家深入研究头孢菌素母环的构效关系，结果表明，有5个部位可供结构修饰或改造，即2位的羧基、3位侧链、5位硫原子、7位氢原子和7位酰胺基侧链。

对2位的羧基进行酯化等可改善口服吸收，提高药物的生物利用度；

3位引入不同的杂原子取代基，可增强抗菌活性，并改变药物在体内的吸收分布及细胞的渗透等药物代谢动力学性质；

5位硫原子可影响抗菌效力，被氧原子或亚甲基取代后，分别称为氧头孢烯和碳头孢烯，它们的稳定性均比头孢烯强，抗菌活性明显提高，但合成难度较大；

7位酰胺基部分是抗菌谱的决定性基团，对其进行结构修饰，可扩大抗菌谱并可提高抗菌活性，增加对β-内酰胺酶的稳定性；7位的-氢原子被甲氧基取代后成为头孢霉素，由于甲氧基的空间位阻，影响了它与酶分子的接近，从而增加了对-内酰胺酶的稳定性。

由此看出，通过上述部位的结构修饰，可衍生一系列头孢菌素类抗生素。

（2）发展历史1948年意大利人Broyzn首先发现了头孢菌素对革兰氏菌有抗性，1956年Abraham等人从头孢菌培养液中分离出头孢菌素C（cephalosporinC）和头孢菌素N，并于1961年运用核磁共振技术确定了头孢菌素C的结构。

1962年美国礼来公司采用化学裂解头孢菌素C合成头孢菌素母核‒‒7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanicacid，7-ACA），由此开创了半合成头孢菌素的研究。

1962年研制出第一个临床应用的头孢菌素‒‒头孢噻吩（cephalothin），其对革氏阳性（G+）菌有良好作用。

1963年Morin等报道了青霉素向头孢菌素的转化反应，从而使得由廉价的青霉素制备头孢菌素成为可能。

1967年美国化学家Woodward等完成了头孢菌素C的全合成，为头孢菌素更深入的化学修饰奠定了基础。

1969年发明了第二代头孢菌素‒‒头孢孟多（cefamandole），抗革氏阳性（G+）菌的活性比第一代头孢菌素明显增强。

1981年出现了第三代注射用头孢菌素‒‒头孢噻肟，1987年出现了第三代口服用头孢菌素‒‒头孢克肟（cefixime）；第三代头孢菌素抗菌谱更广，对β-内酰胺酶高度稳定，但抗革氏阳性（G+）菌活性不如第一、二代头孢菌素。

1992年上市的第四代头孢菌素‒‒头孢匹罗（cefpirome），对G+菌、G-菌、厌氧菌显示广谱抗菌活性，具有第三代头孢菌素的特性，同时增强了对G+的活性，特别对链球菌、肺炎球菌等有很强活性，对-内酰胺酶的亲和力降低，对细胞膜的穿透力更强。

随着头孢菌素类抗生素的广泛应用，细菌耐药性问题越来越严重，其中耐甲氧西林的金葡萄球菌是临床常见的致病菌之一，耐药性强，大多数已上市的头孢菌素类抗生素对其无效。

第五代广谱头孢菌素头孢洛啉（ceftaroline）（2010年上市）和头孢洛扎（ceftolozane）（2014年上市），对耐甲氧西林的金葡萄球菌、革兰氏阴性菌、铜绿假单胞菌以及厌氧菌有较好的疗效。

由于头孢菌素具有高效、广谱、低毒、耐酶等优点，其发展相当迅速，目前己上市了近60个品种，其品种数量居各类抗生素的首位。

根据其抗菌作用特点及临床应用的不同其药理学性质比较参见表16-1，部分结构见图16-2。

表16-1头孢菌素药理学性质

种类

抗G＋活性

抗G-活性

抗绿脓杆菌

酶稳定性

肾毒性

举例

第一代

+++

+

-

差

有

头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢硫脒*、头孢丙烯

第二代

++

++

-

中

小

头孢呋辛、头孢克洛、头孢替安、头孢美唑

第三代

+

+++

-/+++

强

无

头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢哌酮、头孢三嗪、头孢地嗪、头孢克肟、头孢地尼、头孢布烯、头孢帕肟酯、头孢他美酯、头孢托仑匹酯

第四代

+++/++

+++/++++

+++

更强

无

头孢匹罗、头孢吡肟、头孢唑兰、头孢瑟利

第五代

++++

++++

++++

更强

无

头孢洛啉、头孢洛扎

*头孢硫脒由我国（研发单位：

上海医药工业研究院、广州白云山制药股份有限公司）自主研发的头孢菌素类药物。

“+”表示抗菌活性的强弱。

图16-2部分头孢菌素类抗生素结构

16.1.2头孢菌素类生产工艺路线

半合成头孢菌素类的生产工艺路线主要有化学酰化法、微生物酰化法和青霉素扩环法。

化学酰化法又有两种策略，可以先修饰7位，再改造3位；反之亦然。

16.1.2.17位酰化的合成工艺路线

以头孢母核7-ACA或7-氨基脱乙酰基头孢烷酸（7-Aminodesacetoxycephalosporanicacid，7-ADCA）及其衍生物为原料，先将羧酸活化后，再与7位氨基缩合制备相应的头孢类药物。

由于头孢母核的稳定性较差，必须在低温下反应，导致7-位氨基的反应活性不太高，直接与羧酸反应收率偏低，且头孢母核价格昂贵。

为了提高原子利用率，通常需要对羧酸中间体进行活化，主要的活化方式为酰氯法和活性酯法。

在头孢哌酮的工业生产工艺中，将侧链酸D（-）-α-（4-乙基-2,3-双氧代哌嗪-1-甲酰胺基）对羟基苯乙酸（D（-）-α[[（4-Ethyl-2,3-dioxo-1-piperazinyl）carbonyl]amino]-2-（4-hydroxyphenyl）acrticacid，HO-EPCP）与POCl3反应，现场制得酰氯中间体，然后与母核中文名称7-氨基-3-{[（1-甲基-1H-四氮唑-5-基）硫]甲基}-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]-辛-2-烯-2-羧酸，（（6R,7R）-7-amino-3-（（（1-methyl-1H-tetrazol-5-yl）thio）methyl）-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylicacid，7-TMCA）反应，制得头孢哌酮（图16-3），收率在90%以上。

图16-3头孢哌酮的合成工艺路线

如果羧酸制备酰氯比较困难，可转化为活性酯进行酰化。

在头孢噻肟的生产工艺中，在PPh3和Et3N存在下，氨噻肟酸与二（2-苯并噻唑）二硫醚反应制备AE活性酯，然后与母核7-ACA进行反应，制得头孢噻肟（图16-4），收率在95%以上。

图16-4头孢噻肟的合成工艺路线

也可将侧链转化为酸酐再进行酰化反应，在头孢丙烯的生产工艺中，以对羟基苯甘氨酸为原料，由于氨基活性太高，先在有机碱的促进下，与乙酰乙酸甲酯反应制得对羟基苯甘氨酸的邓氏钾盐，然后与特戊酰氯反应现场制备酸酐，最后与头孢丙烯母核反应，制得头孢丙烯（图16-5）。

图16-5头孢丙烯的合成工艺路线

16.1.2.23-位取代的合成工艺路线

以含氮或硫的亲核试剂，如吡啶、吡咯、杂环硫醇等取代7-ACA上的乙酰氧基（OAc），制得的头孢菌素3-位取代衍生物。

在头孢曲松的工业生产工艺中，以7-ACA为原料，乙腈为溶剂，BF3催化下与三嗪环（Thiotriazinone，TTA）发生亲核取代反应，制得中间体7-氨基头孢三嗪（7-amino-3-[（2,5-dihydro-hydroxy-2-methyl-5-oxo-1,2,4-triazin-3-yl）thiomethyl]-cephalosporanicacid.7-Aminoceftriaxonesodium，7-ACT）。

然后在Et3N促进下，四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF）和水的混合溶剂中与AE活性酯反应，得到头孢曲松（图16-6），同时产生副产物2-巯基苯并噻唑。

图16-6头孢曲松的合成工艺路线

16.1.2.3酶法生产头孢菌素的工艺路线

虽然化学酰化法制备头孢菌素的工艺路线比较成熟，但其最大的不足是原子经济性较差。

用AE活性酯制备头孢菌素的工艺中，还产生了对人体和环境有危害的促进剂2-巯基苯并噻唑，这是美国FDA严格限制超标的杂质之一。

近年来，酶法制备头孢菌素引起人们的广泛关注。

头孢克洛的早期制备工艺是以头孢噻吩或7-ACA为原料，但均因工艺复杂且难度较大，原料成本居高不下。

使用固定化青霉素酰化酶合成头孢克洛，具有立体选择性好，无需保护活性位点。

原料7-氨基-3-氯-头孢烯酸（7-amino-3-chloro-3-cephem-4-carboxylicacid，7-ACCA）溶于适量水中，用稀氨水调节体系pH为8.0，使其完全溶解后投入酶反应器中，并加入一定量的固定化青霉素酰化酶（PenicillinGamidase，PGA）。

将溶解侧链PGM-HCl缓慢滴加到酶反应体系中，对反应转化率进行过程监控，大约2h后，转化率可达97%（图16-7）。

由此可见，酶法合成头孢菌素具有反应步骤少，操作简便、无毒害、低成本高收率等优点。

图16-7头孢克洛的酶催化合成工艺路线

16.1.2.4青霉素扩环法生产头孢菌素的工艺路线

日本大塚制药公司首创了青霉素扩环法，制备头孢母核中间体‒‒7-苯乙酰胺基-3-氯甲基头孢烷酸对甲氧苄酯（7-Phenglacetamido-3-chloromethyl-3-cephem-4-carboxylicacidp-methoxybenzylester,GCLE）。

以青霉素G的钾盐为原料，经对甲氧基苄基氯酯化后，再用双氧水将其氧化成亚砜青霉素，然后用芳亚磺酸铵盐（ArSO2NH4）进行扩环。

扩环后的中间体在饱和食盐水和硫酸的混合液中电解氯化，最后与氨水闭环，得到GCLE（图16-8）。

图16-8GCLE的合成工艺路线

以7-ACA为中间体制备的头孢菌素品种中，有60%以上的品种都可以用GCLE来生产。

而且以GCLE为中间体生产头孢菌素时，产品收率更高、生产工艺更简单、生产条件更温和、产品成本更低，特别是在第三代头孢如头孢地尼，头孢克肟，头孢他定等的合成上比7-ACA有非常大的优势；此外GCLE还用于合成一些利用传统三大母核不能合成的新头孢类药物，如头孢丙烯等。

16.27-氨基头孢烷酸生产工艺

7-氨基头孢烷酸（7-ACA）是头孢菌素类最常用的母核之一，通过化学裂解法和生物酶法得到7-ACA。

化学裂解法优点是合成工艺稳定和成熟，通过不断的改进，其收率已经达到85%以上。

此法缺点是反应温度低（例如超低温），对设备要求高，操作费用大。

使用大量的有毒有害的化学物品，给环境和人体健康带来很大的危害。

酶法生产的7-ACA不含溶剂和重金属、质量高，生产占地面积小，环境污染小，成本也低。

从2007年开始，国内企业逐步采用两步酶法替代化学裂解法进行7-ACA生产。

本节从7-ACA的理化性质出发，分析化学裂解和生物酶催化的工业化生产路线、工艺控制及三废处理方法。

16.2.17-氨基头孢烷酸理化性质

7-氨基头孢烷酸（图16-9）的化学名称是（6R,7R）-7-氨基-3-[（乙酰氧）甲基]-8-酮-5-硫杂-1-氮杂二环[4,2,0]-2-烯-2-羧酸，英文化学名称是（6R,7R）-3-acetomethyl-7-amino-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylicacid。

白色结晶性粉末，溶于酸性水溶液，不溶于有机溶剂。

图16-97-氨基头孢烷酸的化学结构

由于7-ACA分子内含有比较活泼的β-内酰胺环和游离的伯氨基，稳定性相对较差。

在长途运输以及室温放置时间较长时，内酰胺环环张力较大可能发生开环，酰胺键断裂，并进一步形成高分子聚合物。

进而可能在合成过程中引入终产物，影响产品质量。

有研究显示，在同等工艺条件下，用保存时间较长7-ACA原料制备头孢噻肟钠，不符合中国药典标准。

16.2.2化学裂解工艺

16.2.2.1工艺路线与原理

以头孢菌素C钠（头孢菌素C的发酵制备见第3章）为原料，制备7-ACA的化学反应及其条件如图16-10所示。

图16-107-ACA的化学合成工艺路线

在CH2Cl2中，头孢菌素C钠盐（CPCNa）与三甲基氯硅烷发生硅脂化反应并脱掉一分子氯化氢制得酯化物。

Et3N和二苯甲胺作为碱和缚酸剂，捕获氯化氢，有利于反应的进行。

在二苯胺的作用下，酯化物与PCl5发生氯化反应，将环外酰胺键转变为氯代亚胺，得到氯化物。

直接在正丁醇溶液中，发生醚化反应，得到醚化物，最后在甲醇和水的混合液中水解得到7-ACA。

16.2.2.2工艺过程与控制

化学裂解法分为四个工段：

酯化、氯化、醚化和水解工段。

具体操作工艺为：

酯化：

在釜内投入无水头孢菌素C钠和CH2Cl2，再加入Et3N及二甲苯胺，且搅拌均匀；其后开始滴加三甲基氯硅烷，控制温度在35℃左右，投料比（1:

10.52:

0.5:

2.32:

2.9），加完三甲基氯硅烷后，继续在25℃~30℃搅拌lh~1.5h，得酯化液。

氯化：

把酯化液放入氯化釜，冷却至-40℃，缓慢加入二甲苯胺、PCl5（1:

1.35:

1.3），控制温度不超过-25℃，加完PCl5后于30℃反应1.5h左右，得到氯化液。

醚化：

当氯化液及正丁醇温度均低于-55℃时，开始滴加正丁醇，加毕，再将反应物冷却至-30℃，并在该温度下搅拌反应1.5h~2h，然后将料液放到水解釜中；

水解：

开启搅拌并加入甲醇和水，水解温度控制在-10℃，时间为5~15min；水解结束后，用浓氨水调节pH值至3.5±0.l，搅拌30min，放置结晶1h，甩滤，用5%甲醇水溶液和2.5%柠檬酸水溶液及丙酮洗涤，真空干燥得到7-ACA，收率80%，纯度97%。

16.2.2.3过程分析

（1）酯化反应需在无水条件下进行，使用无水CPCNa可以显著提高反应收率。

（2）氯化反应过程中慢慢滴加二苯甲胺和五氯化磷，控制温度不超过-25℃，可以减少杂质的产生。

16.2.2.4生产工艺流程图

以头孢菌素C盐为原料，经过酯化、氯化、醚化和水解四步反应制备7-ACA，工艺流程如图16-11所示。

图16-117-ACA的化学合成工艺流程框图

16.2.2.5三废处理

（1）三废分析：

在化学裂解法合成7-ACA的过程中，主要副产物是有机硅化合物，D-α-氨基己二酸正丁酯，HCl气体，还有少量色素，以及过量的二氯甲烷、甲醇、丁醇、有机胺等。

（2）三废处理：

有机硅化合物主要含有六甲基二硅醚和三甲基硅醇，对其进行回收再利用，可以大大减少生产成本。

有机硅化合物回收的一般步骤：

废液经低温蒸馏回收二氯甲烷，再升高温度，回收六甲基二硅醚和三甲基硅醇，随后与HCl在ZnCl2催化下可再生成三甲基氯硅烷。

D-α-氨基己二酸是一类非常有用的氨基酸，可作为合成头抱类等抗生素的原料，并广泛用于医药化工方面，可通过D-α-氨基己二酸正丁酯的水解得到，因此回收D-α-氨基己二酸非常不但可以减少污染，还可以带来经济效益。

回收的一般步骤：

废液在NaOH溶液中搅拌水解，然后用稀盐酸调节pH至D-α-氨基己二酸的等电点3.3，析出晶体，过滤，洗涤烘干得D-α-氨基己二酸。

其它的废气、废水和废液按常规方法处理，达标排放。

16.2.3一步酶催化合成工艺

16.2.3.1工艺路线与原理

头孢菌素C（cephalosporinC，CPC）在头孢菌素C酰化酶（cephalosporinCacylase，CPCA）催化下，选择性发生环外酰胺键的断裂，直接脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链，从而生成7-ACA，副产物D-α-氨基己二酸（图16-12）。

虽然步骤简单，但目前此类酶的活性较低且种类较少，仍处于研发阶段，不具备工业化条件。

图16-127-ACA的一步酶催化合成工艺路线

16.2.3.2工艺过程与控制

（1）制备1.2L头孢菌素C缓冲液（浓度50~75mg/mL,pH=8.5），加到反应釜（含有8000u/LCPCA）中，控制温度25℃以内。

用0.05mol/LNaOH溶液将反应体系pH调至8.5，并控制搅拌转速1200rpm。

取样HPLC分析，当溶液中CPC反应完全时，停止反应。

静置5min，固定化酶沉降。

（2）过滤反应液，加入活性炭脱色，冷却至5℃，加入高分子聚合物的结晶助剂，慢搅拌下，用约60min，采用特殊设备从液面底部滴加15%盐酸，结晶，调整pH至3.8，搅拌养晶60min。

（3）过滤收集结晶，45℃下真空干燥，得白色7-ACA结晶产品，收率97%，纯度98%。

16.2.3.3过程分析

（1）CPC裂解浓度、pH值、裂解温度等对酶活有很大影响，需要选择合适的裂解条件，提高7-ACA的收率。

（2）二氯甲烷等烷烃溶剂在酶裂解液纯化过程中对去除大分子蛋白和氨基酸等杂质效果显著；结晶过程中加入结晶助剂和分散相大大提高结晶颗粒度和结晶产品质量，提高过滤速度和干燥效率。

（3）7-ACA的收率可以达到97%，纯度达到98%，显著高于两步酶法7-ACA的收率90%。

但由于CPCA的生产成本较高，此法尚处于实验室研发阶段。

16.2.3.4生产工艺流程

以头孢菌素C钠为原料，经过一步酶催化合成和过滤、结晶等单元操作，制备7-ACA的工艺流程如图16-13。

图16-137-ACA的一步酶催化工艺流程框图

16.2.3.5三废处理

（1）三废分析：

在合成7-ACA的过程中，主要的副产物是D-α-氨基己二酸，溶剂回收时产生少量废气、废水等。

（2）三废处理：

D-α-氨基己二酸的回收：

废液在NaOH溶液中搅拌水解，然后用稀盐酸调节pH至D-α-氨基己二酸的等电点3.3，析出晶体，过滤，洗涤烘干得D-α-氨基己二酸。

其它的废气、废水和废液按常规方法处理，达标排放。

16.2.47两步酶催化合成工艺

头孢菌素C在D-氨基酸氧化酶（D-AminoAcidOxidase，DAAO）的催化作用下生成一个酮基中间体，并释放出H2O2以及NH3；酮基中间体十分不稳定，非常容易被上述反应中产生的H2O2氧化脱羧生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸（glutaryl-7-amidocephalos-poranicacid，GL-7-ACA。

再在戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶（glutaryl-7-amidocephalos-poranicacidacylase，GL-7-ACA酰化酶）催化下，将GL-7-ACA转化为7-ACA。

对酶进行固定化具有稳定性高、可重复利用等优点。

7-ACA催化所用的酶都是通过交联、吸附、包埋的方式对酶或细胞进行固定化的。

将DAAO固定在有机载体上能显著延长使用时间，常用的固定化载体有：

CNBr活化的agrose、SepharoseHB或DuoliteA365等；有一种新的固定化载体：

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂，先利用酶蛋白变性的方法去除DAAO中的过氧化氢酶，再将DAAO经共价交联到该树脂上，酶对热、pH、O2的稳定性都大大提高，且在催化CPC的过程中，酮酸中间体随反应批次的增加而逐渐减少。

此外，还可采用固定化三角酵母细胞的形式进行催化。

GL-7-ACA酰化酶常用的共价固定化载体有：

环氧乙烷基丙烯酸珠粒和可控制孔径的玻璃珠粒。

此外，还可以先将酶吸附，再同戊二醛交联至阴离子交换树脂上，但此法固定的酶活低于共价固定的平均酶活。

国产固定化GL-7-ACA酰化酶的表观米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）分别为8.69mmol·L-1和76μmol·g-1·min-1，均高于游离酶。

由于GL-7-ACA酰化酶在重组大肠杆菌中有相当一部份可能位于细胞间质，因此也可以采取将重组大肠杆菌直接固定的方法。

16.2.4.1GL-7-ACA合成工艺

（1）工艺原理与过程控制

D-氨基酸氧化酶（D-aminoacidoxidase，DAAO）催化头孢菌素C生成GL-7-ACA的反应如图16-14所示。

图16-14GL-7-ACA的催化合成反应

反应釜A保持反应温度20℃，加入3~4%头孢菌素C钠（CPCNa）盐水溶液，再加入1000u/L的，搅拌速度1200rpm，同时通入氧气。

反应进行中，由于生成的CO2溶于水，pH下降。

用浓度为3mol/L的氨水滴定，保持pH=7.5。

pH波动变小时，取样作HPLC分析。

当溶液中残留CPCNa的色谱含量小于1%时，停止搅拌和通氧，反应停止。

静置5min，固定化酶沉降。

将上层反应液经30μm筛网过滤转入反应釜B中。

反应器中固定化DAAO可连续进行下一批反应。

（2）过程分析

原料纯度：

原料CPCNa中的杂质色素会在反应过程中吸附在载体表面，遮盖了反应活性中心，造成酶活性损失，因此需要高纯度的CPC。

H2O2浓度：

DAAO转化CPC为GL-7-ACA反应过程中H2O2浓度过低，会造成α-酮己二酸单酰-7-ACA积累并分解；积累浓度过高则会氧化DAAO中半胱氨酸和丝氨酸等残基，从而造成酶的失活，同时也会氧化CPC和GL-7-ACA等成为亚砜类物质。

这个问题可采用在反应过程中加入适量的双氧水的方法，使剩余的α-酮己二酸单酰-7-ACA转化为GL-7-ACA，从而提高裂解的收率，再加入适量的H2O2酶除掉多余的H2O2。

搅拌速度：

搅拌要均匀，否则过氧化氢局部积累浓度较高，造成底物氧化损失；局部强碱