分子杂交技术Word下载.docx
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下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:
切口平移法和随机引物合成法。
1.切口平移法（nicktranslation）当双链DNA分子的一条链上产生切口时,DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'
羟基末端。
同时该酶具有从5'
→3'
的核酸外切酶活性,能从切口的5'
端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'
端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
切口平移反应受几种因素的影响:
（a）产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
（b）DNA酶Ⅰ的用量和DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。
（c）DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。
材料：
待标记的DNA。
设备：
高速台式离心机，恒温水浴锅等。
试剂：
（1）10×
切口平移缓冲液:
LTris·
Cl;
LMgSO4;
10mmol/LDTT;
100μg/mlBSA。
（2）未标记的dNTP原液:
除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/LTris·
Cl溶液中,浓度为L。
（3）[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP:
400Ci/mmol,10μCi/μl。
（4）DNA聚合酶Ⅰ（4单位/μl）:
溶于50μg/mlBSA,1mmol/LDTT,50%甘油，50mmol/LTris·
Cl中。
（5）DNA酶Ⅰ:
1mg/ml。
（6）EDTA:
200mmol/L。
（7）10mol/LNH4Ac。
操作步骤:
（1）按下列配比混合:
未标记的dNTP10μl 10×
切口平移缓冲液5μl 待标记的DNA1μg
[α-32P]dCTP或dATP（70μCi）7μl
DNA聚合酶4单位
DAN酶I1μl
加水至终体积50μl
（2）置于15℃水浴60分钟。
（3）加入5μlEDTA终止反应。
（4）反应液中加入醋酸铵,使终浓度为L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
[注意]1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用[α-32P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。
2.随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。
合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。
通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是：
（1）Klenow片段没有5'
外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。
（2）反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。
（3）反应产物的比活性较高,可达4×
109cpm/μg探针。
（4）随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
待标记的DNA片段。
（1）随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。
（2）10×
随机标记缓冲液：
900mmol/LHEPES;
10mmol/LMgCl2。
（3）Klenow片段。
（4）20mmol/LDTT。
（5）未标记的dNTP溶液：
dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。
（6）[α-32P]dATP：
比活性&
gt;
3000Ci/mmol,10μCi/μl。
（7）缓冲液A：
50mmol/LTris·
Cl（）;
50mmol/LNaCl;
5mmol/LEDTA（）;
%SDS。
操作步骤:
（1）200ng双链DNA（1μl）和随机引物（1μl）混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。
（2）与此同时,尽快在一置于冰浴中的eppendorf管内混合下列化合物:
20mmol/LDTT1μl
未标记的dNTP溶液1μl
10×
随机标记缓冲液1μl
[α-32P]dATP（比活性&
3000Ci/mmol;
10μCi/μl）3μl
ddH2O1μl
（3）将步骤
（1）eppendorf管中的溶液移到步骤
（2）管中。
（4）加入5单位（约1μl）Klenow片段,充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒,使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。
（5）在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。
同时计算放射比活性。
[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；
反之，则可获得较长片段的探针。
2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。
二、单链DNA探针
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。
而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。
采用单链探针则可解决这一问题。
单链DNA探针的合成方法主要有下列两种
1）以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;
（2）以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针。
1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。
在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳（如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）将探针与模板分离开。
双链RF型M13DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
材料：
已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。
Klenow缓冲液：
LNaCl,LTris·
Cl;
LMgCl2。
（2）LDTT溶液。
（3）[α-32P]dATP：
（4）40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。
（5）dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。
（6）Klenow片段（5单位/ml）。
（7）适宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
（8）LEDTA（）。
操作步骤：
（1）在eppendorf管中混合如下溶液：
单链模板（约）1mg
适当引物5pmol
Klenow缓冲液3ml
加水至20ml
（2）将eppendorf管加热到85℃5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37℃；
（3）依次加入：
DTT2ml
[a-32P]dATP5ml
未标记的dATP1ml
dGTP,dCTP,dTTP混合液1ml
混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
（4）加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。
（5）加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。
（6）68℃加热10分钟，使Klenow片段失活。
调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。
（7）加入20单位限制性内切酶（如EcoRⅠ,HindⅢ等）酶切1小时。
（8）酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加LEDTA至终浓度10mmol/L。
（9）用电泳方法分离放射性标记的探针。
2.从RNA合成单链cDNA探针cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。
用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:
（1）用寡聚dT为引物合成cDNA探针。
本方法只能用于带Poly（A）的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA3'
末端序列。
（2）可用随机引物合成cDNA探针。
该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。
但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多,应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经SephadexG-50柱层析即可得到单链探针。
材料：
已提纯的RNA或mRNA
（1）合适的引物：
随机引物或oligo（dT）15-18。
（2）5mmol/LdGTP,dATPdCTP,dTTP。
（3）[a-32P]dCTP（&
3000Ci/mmol,10mCi/ml）。
（4）反转录酶（200000单位/ml）。
（5）100mmol/LDTT。
（6）250mmol/LMgCl2。
（7）1mol/LKCl。
（8）LEDTA。
（9）10%SDS。
（10）RNasin（40单位/ml）。
（1）在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：
RNA或mRNA
合适的产物（1mg/ml）
1mol/LTris·
Cl
1mol/LKCl
250mmol/LMgCl2
5mmol/LdNTP
[a-32P]dCTP
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