分子杂交技术Word下载.docx

1、下面将介绍各种类型的探针及标记方法。一、双链DNA探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。1. 切口平移法（nick translation） 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般

2、为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: （a） 产物的比活性取决于-32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。（b） DNA酶的用量和 DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。（c） DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。材料： 待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：（1）10切口平移缓冲液:L TrisCl ; L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100g/ml BSA。（2）未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L TrisCl 溶液中,浓度为L。

3、（3）-32 P dCTP或-32 PdATP:400 Ci/mmol, 10Ci/l。（4） DNA聚合酶（4单位/ l）:溶于50 g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L TrisCl中。（5）DNA酶:1mg/ml。（6）EDTA :200mmol/L 。（7）10mol/L NH4Ac。 操作步骤: （1） 按下列配比混合: 未标记的dNTP 10l 10切口平移缓冲液 5l 待标记的DNA 1g-32 PdCTP或dATP（70Ci） 7l DNA聚合酶 4单位 DAN酶 I 1l 加水至终体积 50l （2） 置于15水浴60分钟。（3） 加入5

4、l EDTA终止反应。（4） 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。注意 1、3H，32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用-32 P-dNTP。2、DNA酶的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。2. 随机引物合成法 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：（1）Klenow片段没有5外切

5、酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。（2）反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。（3）反应产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针。（4）随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。待标记的DNA片段。（1）随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。（2）10随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES ; 10mmol/L MgCl2。（3）Klenow片段。（4）20mmol/L DTT。（5）未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。（6）-32 P dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10Ci/

6、l。（7）缓冲液A：50mmol/L TrisCl （）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （）; % SDS。操作步骤:（1） 200ng双链DNA（1l）和随机引物（1l）混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。（2） 与此同时,尽快在一置于冰浴中的 eppendorf管内混合下列化合物:20mmol/L DTT 1l 未标记的dNTP溶液 1l 10随机标记缓冲液 1l -32 P dATP（比活性&3000Ci/mmol; 10Ci/l） 3l ddH2O 1l （3） 将步骤（1）eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中

7、。（4） 加入5单位（约1l） Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。（5） 在反应液中加入10l缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20下备用。同时计算放射比活性。 注意1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。 2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。二、单链DNA探针用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检

8、测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法主要有下列两种1） 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针; （2） 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针 合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物, 在a-32P-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳（如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）将探针与模板分离开。双

9、链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。材料：已制备好的单链DNA模板（方法参见第十章中有关内容）。Klenow缓冲液：L NaCl, L TrisCl; L MgCl2。（2）L DTT溶液。（3） -32 P dATP：（4）40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。（5）dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。（6） Klenow片段（5单位/ml）。（7）适宜的限制酶，如EcoR、Hind等。（8）L EDTA （）。操作步骤：（1）在 eppendorf管中混合如下溶液：单链模板（约） 1mg 适当引物

10、5pmol Klenow缓冲液 3ml 加水至 20ml （2）将eppendorf管加热到85 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37；（3）依次加入：DTT 2ml a-32PdATP 5ml 未标记的dATP 1ml dGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml 混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。（4）加1ml（5单位）Klenow酶室温下30分钟。（5）加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。（6）68加热10分钟，使Klenow片段失活。调整NaCl浓度，使之适宜于酶切。（7）加入20单位限制性内切酶（如EcoR, Hind等）酶切1小时。（8）酚/氯仿抽提DNA，乙

11、醇沉淀以去除dNTP或加L EDTA至终浓度10mmol/L。 （9）用电泳方法分离放射性标记的探针。 2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种: （1）用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly（A）的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3末端序列。（2） 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。

12、 反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。 材料：已提纯的RNA或mRNA（1）合适的引物：随机引物或oligo（dT）15-18。（2）5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。（3） a-32PdCTP（&3000Ci/mmol, 10mCi/ml）。（4）反转录酶（200000单位/ml）。（5）100mmol/L DTT。（6）250mmol/L MgCl2。（7）1mol/L KCl。（8）L EDTA 。（9）10% SDS。（10）RNasin（40单位/ml）。（1）在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：RNA或mRNA 合适的产物（1mg/ml） 1mol/L TrisCl 1mol/L KCl 250mmol/L MgCl2 5mmol/L dNTP a-32PdCTP